双载体转重链Tyr664Cys和轻链Thr1286Cys突变体BDD-FVIII基因.PDF

中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2012, 34(1): 18–24 研究论文 双载体转重链Tyr664Cys和轻链Thr1286Cys突变体 BDD-FVIII基因 * 朱甫祥 　杨树德 刘泽隆 缪 静 屈慧鸽 迟晓艳 (鲁东大学生命科学学院, 烟台 264025) VIII AAV 摘要 用双载体转运凝血 因子基因在甲型血友病基因治疗研究中可克服 毒载体容 量限制, 但存在重链分泌低效和链不均衡性问题。为探索重、轻链间二硫键形成对重链分泌的促 B FVIII(BDD-FVIII) Tyr664 进作用, 该文用双载体转 结构域大部缺失型 的重链和轻链基因, 将重链的 Thr1826 Cys HEK293 和轻链 突变为 , 研究了 细胞共转基因后的基因表达、分泌至培养上清的重链量 和凝血生物活性。用Western blot检测细胞裂解液结果显示, 非还原条件下有明显的二硫键交联的 重、轻链蛋白; 链特异性ELISA定量检测细胞分泌的重链为(125±29) ng/mL, 明显高于共转野生型 重链和轻链基因细胞的(75±23) ng/mL; Coatest法显示细胞分泌的凝血活性为(0.78±0.29) U/mL, 也 明显高于共转野生型重链和轻链基因细胞(0.34±0.12) U/mL。结果表明, 重、轻链间的二硫键形成 可提高双载体转FVIII基因的功效, 为进一步在动物体内转基因提供了实验依据。 VIII ; ; ; 关键词 凝血 因子 双载体 链间二硫键 重链分泌 在血友病基因治疗研究中, 腺相关病毒(adeno- 1 材料与方法 associated virus, AAV)载体因可介导转基因在肝脏 1.1 材料 或肌肉内持续稳定表达, 使其成为血友病治疗的理 BDD-FVIII 的真核表达质粒载体pCMV-F8 由 想载体[1-2] FIX 本实验室构建并保存。含有BDD-FVIII 重链、轻 。但相对于 缺陷所致的乙型血友病, FVIII缺陷引起的甲型血友病的基因治疗研究滞后, 链与split Ssp DnaB 蛋白内含子的融合基因表达质 主要原因为AAV 的容量限制[3] 。FVIII 的编码序列为 粒pCMV-HCIntN 、pCMV-IntCLC 为我们以前工作 7 Kb B (BDD-FVIII) [10] HEK293 , 其 结构域缺失型功能性分子 为 中构建 。 细胞购自中国科学院典型培养 4.37 Kb, 加上基因表达调控序列, 超过AAV载体的 物保藏委员会细胞库; Pfu Turbo DNA聚合酶购自 (4.4 Kb)[4] FVIII Stratagene DNA New Eng- 容量上限 。双载体转 基因技术, 克服 公司; 连接酶试剂盒购自 AAV land Biolabs Gel Extraction Kit PCR Purifica- 了 载体容量限制, 但突出的问题是由重链分泌 公司;