蛋白质的分离纯化王镜岩生物化学(全).ppt

研究蛋白质的结构、性质和活性蛋白质的功能，首先需要得到纯的、没有变性的蛋白质样品。 分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括： 1.分子的大小和形状、 2.酸碱性质、 3.溶解度、 4.吸附性质 5.对配体分子的特异生物学亲和力。 蛋白质的等电点 蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分子中保留着游离的末端α—氨基和α—羧基以及侧链上的各种功能团。蛋白质也是一类两性电解质，能和酸或碱发生作用。可解离基团主要来自侧链上的功能团 . 对某一种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正电荷与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一pH称为蛋白质的等电点（与蛋白质所含氨基酸种类有关）。 蛋白质的等离子点是特征常数 蛋白质的电泳 在等电点时(Isoelectric point pI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在大于等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在小于等电点的溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。 电泳 利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。 常用测定方法： 1、根据化学组成测定最低相对分子质量 2、凝胶过滤法测定相对分子质量 3、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量 4、渗透压法 5、沉降分析法（离心） 一、根据化学组成测定最低相对分子质量 用化学分析方法测定出蛋白质中某一微量元素的含量，并假设蛋白质分子中只有一个铁原子。则可以由此计算出蛋白质的最低相对分子质量。 例如，肌红蛋白含铁量为0.335％，其最低相对分子质量可按下式算出： 最低相对分子质量= （铁的原子量/铁的百分含量）X 100=（55.8/0.335）X100=16700 二、凝胶过滤法测定相对分子质量 凝胶过滤原理 利用Andrews的实验经验式： logMr = a/b—Ve/bVo Ve（elution volume）为某一溶质组分的洗脱体积。它是自加样品开始到该组分的洗脱峰（峰顶）出现时所流出的体积。 V0 (outer volume)为外水体积，即存在于柱床中凝胶珠外孔隙的水相体积。测定出不能被凝胶滞留的大分子溶质如蓝色葡聚糖—2000的洗脱体积可以决定V0。 三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量 聚丙烯酰胺凝胶电泳，（简称PAGE），也称圆盘电泳，它以聚丙烯酰胺凝胶（单体丙烯酰胺Arc和交联剂甲叉双丙烯酰胺Bis共聚而成）为支持物 。 蛋白质颗粒在各种介质中电泳时，它的迁移率决定于它所带的电荷以及分子大小和形状(电荷效应、分子筛效应)。 在聚丙烯酰胺凝胶中由于引入凝胶的分子筛效应，电泳迁移率与多肽链分子量的对数有下列关系： log Mr = a—bμR 式中Mr为相对分子质量，a、b都是常数，μR是相对迁移率： μR = 样品迁移距离/前沿（染料）迁移距离 实验测定时，以几种相对分子质量标准物蛋白质的Mr的对数值对其μR值作图，根据待测样品的μR,从标准曲线上查出它的Mr。 一、蛋白质的胶体性质 A、分散相的质点大小在1-100nm范围内。动力学上稳定，能作不断的布朗运动。 真溶液（1nm） 胶体溶液 悬浮液(100nm） B、分散相的质点带有同种电荷，互相排斥，不易聚集成大颗粒而沉淀。 C、分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层（如水化层） 蛋白质溶液性质： 1、蛋白质分子颗粒在1-100nm范围内。 2、形成水化层：分子表面上亲水基团在水溶液中能与水分子起水化作用 3、构成稳定的双电层：分子表面上的可解离基团，在适当的pH条件下，都带有相同的净电荷，与其周围的反离子构成稳定的双电层。 4、蛋白质溶液也和一般的胶体系统一样具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 二、蛋白质的沉淀 蛋白质在溶液中的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关，是有条件的、相对的。如果条件发生改变，破坏了蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。 在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。 在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化