白藜芦醇对模拟日光照射后黑素及朗格汉斯细胞影响.docVIP

白藜芦醇对模拟日光照射后黑素及朗格汉斯细胞影响[摘要]目的:观察白藜芦醇对模拟日光照射后黑素和朗格汉斯细胞的影响。材料和方法:招募11名健康女性志愿者,在每位志愿者背部选取6个非曝光部位。部位1～4分别涂抹白藜芦醇+抗氧化剂、抗氧化剂、白藜芦醇、基质,30min后予1.5倍最小红斑量的模拟日光照射,部位5仅予照射而不涂抹检测物质(阳性对照),部位6既不照射亦不涂抹检测物质(阴性对照)。每天照射一次,连续照射4天。末次照射后24h对皮肤进行取材,进行Fontana Manna 染色及CD1a免疫组化染色。结果:阳性对照部位和涂抹基质部位黑素含量指数 (melanin content index,MCI) -目标面积/场面积比值(%)及平均光密度值显著上升,朗格汉斯细胞显著减少;而双侧涂抹白藜芦醇+抗氧化剂、抗氧化剂、白藜芦醇的部位MCI-目标面积/场面积比值(%)及平均光密度值轻度上升,朗格汉斯细胞轻度减少,与阳性对照部位和涂抹基质的部位相比具有显著差异(P 1.3 实验仪器:日光模拟器(GS2006 3.0E版,中国计量科学研究院,北京),包括一个450W的氙灯加上一个WG320 滤光片(Schott,Clichy,France),光线输出模拟连续的290 nm 至400nm 的日光紫外线输出,可发射出15倍太阳光强度的模拟日光。 1.4 实验方法:①试验开始前测定每位志愿者MED;②在志愿者背部6个部位进行如下操作:部位1～4分别涂抹白藜芦醇+抗氧化剂、抗氧化剂、白藜芦醇、基质30min后予1.5倍MED的ssUVR,部位5仅予照射而不涂抹检测物质(阳性对照),部位6既不照射亦不涂抹检测物质(阴性对照)。详见表1。各照光部位每日照射1次,连续照射4天。末次照射后24h对受试部位皮肤取材,用10%甲醛固定后行石蜡切片,进行Fontana Manna 染色及CD1a免疫组化染色。 1.5染色方法 1.5.1Fontana Manna染色:①切片常规用二甲苯脱蜡,经各浓度乙醇至水洗;②蒸馏水清洗5min×2次;③将切片置于GRAM液中10min;④用蒸馏水彻底清洗1h;⑤将切片置于FONTANA染液中,避光放置24h。蒸馏水清洗5min×2次;⑥在切片上滴加0.1%氯化金30μl,4min,蒸馏水清洗5min×2次;⑦5%硫代硫酸钠固定2min,蒸馏水清洗5min×2次;⑧ 过滤好的KERNECHTROT染液,染色5min;⑨乙醇、二甲苯脱水、透明。中性树胶封片,镜下观察。 1.5.2CD1a免疫组化染色(S-P法):①切片常规用二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水;②置于pH6.0的柠檬酸盐缓冲液中,121。C蒸汽高压消毒箱内抗原热修复10min;③自然冷却后,3%H2O2去离子水孵育5～10min。PBS冲洗,2min×3次;④滴加一抗,4℃冰箱过夜。PBS冲洗,2min×3次;⑤滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体,37℃孵育30min;PBS冲洗,2min×3次;⑥显微镜下控制DAB显色,大约5～20min。蒸馏水冲洗;⑦苏木素复染;⑧乙醇、二甲苯脱水、透明,中性树胶封片。 1.6结果判断标准:①MCI:使用Image-Pro-Plus 6.0多媒体彩色病理图文分析系统,对Fontana Manna法染色切片进行MCI计数;每张切片连续选取10个非重叠视野,测定受检基底层和棘细胞层内黑素颗粒面积占该处表皮基底层和棘细胞层总面积的百分比及平均光密度值;②朗格汉斯细胞:于400倍光镜下,每张切片连续选取10个非重叠视野计数朗格汉斯细胞总数。 1.7统计学分析:采用16.0版SPSS软件包进行统计学分析。各组间数据比较采用方差分析。P 1