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眼针对局灶脑缺血再灌注损伤保护机制探究3.沈阳市中医院，辽宁 沈阳 110003） 摘 要：目的：探讨眼针疗法治疗缺血脑血管病的可能机制。方法：采用随机分组将大鼠分为假手术组、模型组与眼针组，改良的线栓方法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型；取上焦区、下焦区、肝区、肾区为施加因素；采用神经功能缺损评分，TUNEL法检测细胞凋亡。结果：眼针组与模型组比较神经功能缺损评分统计学差异（P 1.6 标本制作 各组大鼠根据不同时间灌注固定取脑。重新测大鼠体重，10%水合氯醛 （600mg/kg ）腹腔注射深度麻醉后，将鼠仰卧固定于大鼠固定架上，提起剑突下缘上腹部皮肤，纵行剪开胸前部皮肤直至锁骨上窝，提起剑突沿胸骨前壁剪开膈肌，沿胸骨旁线剪开前胸壁固定，剪开心包暴露心脏。从心尖部沿左心室插入灌注管至升主动脉入口，剪开右心耳，先用0.9%生理盐水150mL快速冲洗组织内血液，将大鼠体内血液置换干净（从右心房流出液体由血性转为清澈），再用4%多聚甲醛固定液快速灌注100mL，再缓慢灌注100mL,直至鼠尾巴翘起，身体逐渐僵硬，颜色变白为止。灌注固定完成后，迅速断头取脑。轻轻打开颅腔，暴露出大鼠脑组织。用眼科剪轻轻将与脑组织相连的硬脑膜剥离，切断延髓取出右侧脑组织。弃去嗅球、小脑和低位脑干，取材范围包括梗死区及其周围的脑组织，用生理盐水冲洗，自额极至中脑间（距额极7-11mm）脑组织，入4℃4%多聚甲醛固定液中固定过夜，进行常规脱水、透明、石蜡包埋，连续冠状切片。 1.7 细胞凋亡检测（TUNEL法） 1.7.1 实验步骤 常规脱蜡至水，把石蜡切片依次放入： 二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ10min→无水乙醇Ⅰ5min→无水乙醇Ⅱ5min→90%乙醇5min→80%乙醇5min→70%乙醇5min→蒸馏水冲洗→滴3%H【sub】2【/sub】O【sub】2【/sub】室温10min→蒸馏水冲洗3次。取TBS1∶200新鲜稀释Proteinnasek 37℃，消化15min；TBS洗2min，3次。加标记缓冲液20ul/片（用TBS代替标记液作阴性对照），按每张切片去TdT和DIG-d-UTP各1微升，加入18微升标记缓冲液中，混匀后加入，置湿盒中，37℃，标记2h。TBS皮潦草2min，3次。加封闭液50μL/片，室温放置30min，甩掉封闭液，不洗。用抗体稀释液1∶100稀释生物素抗地高辛抗体，混匀后50μL加至切片上，置湿盒中，37℃，30min；TBS 2min，3次。用抗体稀释液1∶100稀释SABC,混匀后50μL加至切片上，置湿盒中，37℃反应30min；TBS2min，3次。DAB显色，镜下观察，水洗。苏木素轻度复染，TBS洗，蒸馏水洗，脱水封片。 1.7.2 细胞凋亡切片图像结果分析方法 采用数码医学图像分析系统，光镜下可见细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性表达，即凋亡的细胞。每组选8张切片，利用显微摄像系统，取每张切片中梗塞灶边缘区域相互不重叠的4个视野（×200）按照像素分布摄入图像并保存于病理图像分析系统内，选择凋亡分析模块，通过灰度调节，区分视野内凋亡细胞个数，计算凋亡细胞数，取平均值进行统计学分析，见图1。 1.8 统计学方法 所有实验数据以均值土标准差（±s）表示，所得数据用SPSS 10.0软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析。 2 结 果 2.1 神经功能缺损评分结果 假手术组大鼠手术完成后，无神经缺损体征出现，模型组、眼针组于再灌注即刻出现明显神经功能缺损症状，证明模型制作成功。模型组、眼针组神经功能缺损症状经统计学处理（P0.05）。再灌注3h，眼针组与模型组两组间比较无统计学意义（P0.05）；再灌注24h，神经功能缺损最严重，模型组眼针组与模型组两组间比较有极显著差异（P0.05；?P 1