育麟颗粒对排卵障碍大鼠下丘脑神经元ERα仪表达影响.docVIP

育麟颗粒对排卵障碍大鼠下丘脑神经元ERα仪表达影响摘要：目的：通过观察育麟颗粒对排卵障碍大鼠下丘脑弓状核神经元ERα表迭的影响，探讨育麟颗粒对肾虚排卵障碍促排卵的可能机制。方法：大鼠肌注氢化可的松造模后，随机分为模型组、西药对照组、育麟颗粒低、中、高剂量组，检测受试大鼠体重变化情况、卵巢的卵泡数目、黄体数目、下丘脑弓状核雌激素受体α(ERα)表达等指标。结果：育麟颗粒各剂量组体重明显升高，肾阳虚症状明显恢复，与模型组相比有显著性差异(P＜0.1)。育麟颗粒各剂量组发育卵泡数和黄体数目均显著高于模型组。育麟颗粒各剂量组大鼠下丘脑弓状核ERα表达水平均显著高于模型组(P＜0.01)。结论：育麟颗粒对于排卵障碍的治疗，是通过多途径和多靶点作用的。在对机体的整体调节上育麟颗粒明显优于克罗米芬。 关键词：排卵障碍；肾阳虚；雌激素受体α；下丘脑 中图分类号：H285.5　文献标识码：A　文章编号：1673－7717(2007)09－1881－03 排卵功能障碍是临床上导致功血、闭经、不孕等多种妇科疾病的主要因素之一。育麟颗粒是已故国家级名老中医何子淮主任医师的经验方，临床用于肾阳虚型排卵障碍性疾病数十年，对于调经、促排卵、助孕均取得满意疗效。本实验通过建立肾阳虚排卵障碍动物模型，对育麟颗粒促排卵作用机制进行探索性研究，阐明其促进卵子发育和卵巢排卵的干预环节。 1　材料与方法 1．1　主要试剂及药品 (1)氢化可的松注射液100mg/20mL：天津金耀氨基酸有限公司，批号0505181；(2)克罗米芬胶囊50mg/粒：上海衡山药业有限公司，批号040901；(3)育麟颗粒协定方：杭州市中医院中药房提供；(4)兔抗鼠ERα免疫组化一抗(sc－542)：SANTA CRUZ公司；(5)羊抗兔免疫组化二抗(PowerVision二步法免疫组化检测试剂)：DAKO公司；(6)多聚甲醛：天津市化学试剂研究所。 1．2　实验对象　雌性SD大鼠60只，体重(250±10)g；购自中国科学院上海实验动物中心。由浙江中医药大学动物实验中心饲养。每天由动物中心实验室人员控制光亮时间为6:00－19:00，黑暗时间为19:00－次日6:00。 1．3　实验方法　造模方法，成年雌性SD大鼠每日下肢肌注氢化可的松注射液36mg/kg，11天。动物外观见竖毛、毛元光泽，拱背少动，饮食减少，体重下降，反应迟钝，呼吸深迟，肉眼未见外生殖器潮湿、阴道口变大、触之兴奋等动情期反应，造模期间陆续发生死亡。肌注氢化可的松第6天起连续阴道涂片1个性周期(5天)。用移液器吸取生理盐水50μL反复冲洗大鼠阴道2－3次，然后将冲洗液均匀涂于干净的玻片上，干燥后采用瑞氏－姬姆萨染色法。放入瑞氏染液中8min，自来水冲洗，再放入姬姆萨染液中1min，自来水冲洗。自然干燥后光镜下细胞学检查，确定大鼠的动情周期。造模后大鼠阴道涂片周期性变化消失。 成年雌性SD大鼠60只，随机分为6组，每组10只。第1组为空白对照组，后5组建立动物模型，分别为模型组、西药对照组、育麟颗粒低、中、高剂量组。空白对照组每日肌注等容积生理盐水，其余5组按上述造模方法肌注氢化可的松。11天后按组别用药治疗。治疗期为10天。 大鼠剂量(g/kg)=成人剂量(g)×0.018/0.2kg作为大鼠等效剂量。育麟颗粒按等效剂量1、2、4倍作为低、中、高剂量组剂量标准。克罗米芬胶囊大鼠剂量为4.5mg/kg，用蒸馏水将其配成混悬液，模拟人的月经周期，在10天的治疗期(2个性周期)中，性周期的头2天给药，每次4.5mg/kg，后3天停药。 各组给药10天后，在3％的戊巴比妥钠麻醉下(45mg/kg，腹腔注射)，开胸，暴露心脏及主动脉，用钝头大号注射器针头经左心室插管至主动脉，先用生理盐水100mL快速灌流至无血色，后以4％多聚甲醛350mL(以0.1mol/L PBS配置)灌注固定45min，开颅取大鼠全脑，按包新民，舒斯云著《大鼠脑立体定位图谱》中的定位分离下丘脑。将下丘脑组织块立即放人到4％多聚甲醛中固定备用。开腹解剖分离出卵巢放人到10％甲醛中固定备用。 分别取两侧卵巢的最大切面，常规HE染色，光镜观察，辅以目镜测微器。观察卵巢卵泡及黄体发育情况等。下丘脑组织块放入到4％多聚甲醛中固定24h后，按常规切片。切片过程中均将其置于光镜下对照《大鼠脑立体定位图谱》观察，确保切到下丘脑弓状核所在部位。 免疫组化采用PowerVision两步法。脱腊及水化后，3％H2O2室温孵育10min以灭活内源性过氧化物酶。抗原修复后，滴加适当的兔抗鼠ERα抗体工作液，湿盒中孵育，4℃冰箱过夜。PBS冲洗。滴加山羊抗兔免疫组化二抗，37℃孵育30min。PBS冲洗。DAB显色剂