LC制药行业应用高级培训班_part4_如何建立HPLC法测定有关物质的方法.ppt

* 有关物质在质量标准中的制订 3. 制剂有关物质的检测方法一般应与其原料药有关物质的检测方法相同。含量测定方法也应尽量与有关物质测定方法相同，并最好稀释一定倍数。 4. 如分离检测出若干个杂质峰，在制订总杂质限度的基础上可考虑制订单个杂质限度。 5. 测定制剂时，辅料是否对测定有干扰。如有干扰（通常出峰较快），可考虑采用规定时间限度的方法予以排除。 * * * * * 药品研究及生产过程中有关物质的控制方法和要求 上海药检所化学室 谢沐风 * 有关物质的来源 原料药合成过程中带入; 制剂过程中产生; 或是在贮藏、运输、使用过程中产生。 控制的必要性 * 有关物质的测定方法 仪器角度： 高效液相色谱法（HPLC法）、 薄层色谱法（TLC法）、 紫外分光光度法（UV法）、 气相色谱法（GC法）、 毛细管电泳色谱法（CE）等 试验角度： 对照品法 自身（稀释）对照法 归一化法 * 有关物质的计算方法 杂质对照品法 加响应因子（即重量校正因子）计算 的自身对照法、 不加响应因子计算的自身对照法 根据不同杂质采用不同方法等。 有关物质的计算方法 定量检测和限度检测 * 高效液相色谱法（HPLC法） 1 .色谱条件的确定（即专属性试验） 专属性是提供被分析物在杂质和辅料存在时能被区分的证明，通常采用在纯物质（原料或制剂）中加入一定量的杂质或辅料，证明各杂质均可与被分析物分离。 配制含有1%(w/w)浓度各中间体（即各杂质）的主成分对照品溶液作为系统适用性试验用溶液，来确证色谱条件的适用性。 * 专属性试验验证图谱 * 2 . 检测波长的确定 涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是否相同，即所谓重量校正因子的问题。（f=A杂质/A被测成分） 选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长（f=1.0）。 选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长（f1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。 如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波长，应必须加入重量校正因子（f1.0），否则将得到错误的判断。 目前国外有关该项研究的进展 * 3. 供试品溶液浓度的确定 （灵敏度试验——最低检出量的测定） 供试品溶液浓度的设定至关重要。通常其设定是依据最低检出量和最大进样量来进行的。 最低检出量虽然是个绝对值，但其真正的意义确是其相对值，即相对于供试品溶液中样品浓度的多少而言。 其测定方法分为直观评价法和依据信躁比两种方法。 最大进样量以不断增加样品溶液浓度，直至被分析物不拖尾的浓度为准。 * 3. 供试品溶液浓度的确定 设定杂质总量不得过1.0%，最低检出量通常需达到对照溶液浓度的1/10~1/50（即相当于供试品溶液浓度的0.1%~0.02%）。也就是说供试品溶液的浓度至少是最低检出量的1000倍~ 20000 倍，又由于最低检出量受各因素的不同而改变（即耐受性因数），故供试品溶液的浓度在保证不拖尾的情况下（即小于最大进样量），可在此基础上再设定的高一些，以保证该浓度可适用各种条件。 * 3. 供试品溶液浓度的确定 举例说明：进样量为20μl，主成分的最低检出量为1μg/ml（以浓度表示），规定杂质限度为1%，此时供试品溶液的浓度可设定为 1mg/ml ~20mg/ml，或者再高一些，但始终需保持主成分峰不拖尾为准，即不超过最大进样量。 拖尾情况也可通过流速进行适当调节 * 3. 供试品溶液浓度的确定 * 4. 加样回收试验（即准确性试验） 准确性试验可采用样品中加入已知量杂质的方式来评价。准确称量各杂质，将含有1% (w/w)浓度的各杂质加入到样品溶液中，以验证所采用的色谱条件是否可分离检出出相应的各杂质。该原理同前面所述的专属性研究是一致的。 * 5. 流速、柱温与溶剂的选择 在测定时通常调节流速使主成分保留时间稍长些，且使主成分峰不拖尾即可。 柱温对分离效果的影响虽有一定的影响，但不甚显著，如有柱温箱，通常设定不超过35℃。 溶剂的选择应测定样品溶液在该溶剂中的稳定性来衡量，尽量勿选择挥发性强的溶剂；同时应保证对照溶液的主成分峰面积精密度良好。 * 6. 积分参数的设定 积分参数的设定是非常重要的。它主要由斜率(Slope)、峰宽(Width)、最小峰面积(Min Area)组成。 采用自身对照法时，对照溶液与供试品溶液必须在同一斜率、峰宽下进行积分计算。 这里主要是供试品溶液的最小峰面积设定，它将直接导致测定结果。设定的太