a-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用实验教案--.doc

实验三 α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测 一、实验目的 1.制备固定化的淀粉酶。 2.进行淀粉水解的测定。 二、实验原理 用吸附法将a-淀粉酶固定在石英砂上，一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示剂溶液测试，流出物呈红色表明水解产物糊精生成。 这里使用的是枯草杆菌的a-淀粉酶，其作用的最适pH范围为5.5-7.5，最是温度为50-75℃。 1、酶的固定化 酶：生物体内活细胞产生的具有催化作用的有机物。 固定化酶：将水溶性酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。 直接使用酶缺点 固定化酶优点 通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活 固定化酶提高了酶的稳定性，可较长时间地储存和使用；（更能耐受温度、PH的变化） 溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本 固定化酶可以被反复使用，更经济，更利于生产 反应后会混在产物中，可能影响产品质量(难分离） 酶既能与反应物接触，又能与产物分离纯化 一般酶的固定化方法：吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法。 吸附法： P32利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和离子吸附法。 常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。 采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。 2.石英砂的吸附作用 石英砂吸附酶的物理吸附也称范德华吸附，它是由吸附质和吸附剂分子间作用力所引起，此力也称作范德华力。由于它是分子间的吸力所引起的吸附，所以结合力较弱，吸附热较小，吸附和解吸速度也都较快。被吸附物质也较容易解吸出来，所以物理吸附在一定程度上是可逆的。30，看到原理第二段，我请一位同学起来读一下：固定化酶就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。 好，我们了解了固定化酶的概念，那固定化酶有哪些优点呢？大家来看一下资料。 我们要做的实验是α—淀粉酶的固定化，那……为什么要选用α—淀粉酶呢？ ①水溶性酶②它的反应物和产物都容易被检测③便宜易寻 今天我们要用的固定方法是吸附法，什么是吸附法呢？ 请大家往后翻一页，翻到P32，看到资料有哪些信誉好的足球投注网站1，我请一位同学来读一下第一段：利用吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定的方法，通常有物理吸附和离子吸附。 好，吸附法通常有物理吸附和离子吸附，简单地说，物理吸附就是利用范德华力进行吸附，而离子吸附则是利用的离子正负电荷相吸的原理。当然，方法不止一种，具体的请大家自己课后查一下。 刚才同学们说到，固定化酶就是将水溶性的酶用某种方法固定在某种介质上，那用什么介质来固定？好，石英砂在这里就闪亮登场了，为什么采用石英砂呢？它的吸附原理是怎样的？首先，大家来看一下原理，它是通过分子间的范德华力，与α—淀粉酶很好的结合吸附，石英砂在这儿采用的就是物理吸附。同时它具有良好的惰性，不与底物、产物发生反应。 好，α—淀粉酶、石英砂有了，具体怎么固定呢？我们就开始做实验了。 首先，在50ml烧杯中将5mg α—淀粉酶溶于4ml蒸馏水中，如果有不溶物，大家不要担心，这是由于酶不纯所引起的，属于正常现象。接下来，再加入5g石英砂，不时地轻轻搅拌，固定化15分钟。注意，搅拌时用力不可太猛，时间不能过长，以免石英砂被磨细影响后续实验，由于固定需要15分钟，时间过长，所以这一步骤我们已为大家准备好。 固定好之后就可以装柱了，大家看这个层析柱，下面有一个小孔，我们可不可以直接将石英砂倒进去啊？石英砂会漏下去对不对？那我们就将一块滤布塞入柱中，用玻璃棒沾一点杯子中的水，把滤纸润湿，让滤纸贴在层析柱中，接下来就可以将石英砂转移进柱中，用蒸馏水辅助，将杯子中剩下的石英砂尽量全部转移进层析柱中，同时要打开层析柱下方的调节装置，使多余的液体流出。这里同学们要注意了，装柱时应尽量使石英砂的表面平整，填实一些，这样可以使淀粉溶液充分与酶反应。 好了，装完柱之后我想问大家一个问题，是不是所有的a-淀粉酶都被固定在石英砂上了呢？那游离的α—淀粉酶应该怎么处理呢？洗到什么程度，又如何检测呢？请大家结合淀粉水解原理讨论一下。 α-淀粉酶 β淀粉酶 糖化淀粉酶 淀粉 糊精 麦芽糖 葡萄糖 遇碘显蓝色 遇碘显红色 我们小心倒掉上清液后，（每次）用10-15ml的蒸馏水小心清洗石英砂2-3次，每次取其上清液0.5ml于试管中，同时滴加淀粉溶液充分混匀。再加入1-2滴KI-I2 溶液，若溶液变为蓝色，说明中已无游离α—淀粉酶，如果溶液为红色，继续用蒸馏水清洗，直