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SDS自制胶操作规程 一：试剂准备 SDS电泳所用溶液： 30 %聚丙烯酰胺溶液 (100 mL) 丙稀酰胺(Arc)29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺(Bis)0.8g，加入去离子水定容至100mL，过滤于玻璃瓶中4℃贮存。0 %聚丙烯酰胺溶液0 %，冰箱4℃保存。 分离胶缓冲液1.5mol/L Tris·HCl，8.8：.23gTirs碱，溶于80mL去离子水中，加盐酸调节H值至8.8，定容至1mL。 .5mol/L Tris·HCl，.8：Tirs碱，溶于去离子水中，加入盐酸调节H值至6.8，定容至100mL。 10％SDSSDS溶于去离子水中，定容至，加热至68℃助溶。 0％过硫酸铵：过硫酸铵，溶于去离子水中；现配现用。 N-N-N`-N`－四甲基乙二胺原液，室温保存。×Tris-甘氨酸缓冲液 (1 L)Tris碱 甘氨酸(电泳级) g SDS 1g 2×SDS凝胶加样缓冲液Tris-Cl (pH 6.8) 1 mL SDS 0.25g 甘油 0.189g β-巯基乙醇 (DTT（二硫苏糖醇） 溴酚兰 双蒸水 定容到5ml 考马斯亮蓝染色液 考马斯亮蓝R-250 1.0 甲醇 450 mL 冰醋酸 100 mL ddH2O 450 mL 考马斯亮蓝脱色液mL乙醇mL 冰醋酸 mL ddH2O 450mL PH7.4PBS（0.01M）1L KH2PO4 1 mL Na2HPO4 0.25g NaCl 0.189g KCl 2.5ml 二：凝胶配置 1 2 3 4 1．将短玻璃板放在带有边条的长玻璃板上，做成玻璃板夹心。玻璃板应保持干燥洁净。 2．将玻璃夹心放入灌胶架，短玻璃板冲前。两块玻璃板底部齐平。 3．锁紧夹子（绿色），夹紧玻璃板夹心，做成灌胶模块。 4．把灰色的橡胶垫放在灌胶架底部，将灌胶模块放在灰色的胶垫上，灌胶架上部一透明夹子，用此夹子夹住长玻璃板。 5．配制凝胶，以下为常用的SDS凝胶体系 分离胶: 12% 15% H2O 3.4 ml 2.4 ml 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 2.5ml 2.5 ml 10% (w/v) SDS 0.1 ml 0.1 ml 30 %聚丙烯酰胺溶液 ml 5.0 ml 10% (w/v) (APS) 0.05 ml 0.05 ml TEMED 0.005ml 0.005ml 浓缩胶 (5%): H2O 2.8 ml 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 1.25 ml 10% (w/v) SDS 0.050 ml 30 %聚丙烯酰胺溶液0.9 ml 10% (w/v) (APS) 0.025ml TEMED 0.004 ml 先按顺序加入各项试剂配好分离胶后，倾斜模具，灌胶至距离梳齿下端0.5-1cm处，从两端用去离子水缓慢压平，放置到37℃恒温箱半个小时凝胶后，倒掉去离子水，残余的水用滤纸条吸干净；再按顺序加入各项试剂配制浓缩胶，灌满模具缓慢插入梳子，注意不要产生气泡。 6 7 8 9 10 6．凝胶凝固后，取出梳子，加入准备好的样品。把玻璃板夹心（凝胶）从灌胶架上取下。 7．把玻璃板夹心放入电泳架，短玻璃板面冲里，做成电泳模块。 8．把电泳模块完全插入电泳架。 9．合上电泳架上的密封夹。如只跑一块胶，在另一侧放入随仪器配的挡板；在装配的过程中，会觉得很紧，为正常现象。 10．将整个装配好的电泳架放入电泳槽。 11．样品处理以干扰素为例： 离心菌种： 离心后的菌体，加入200ul的PH7.4的PBS溶解，超声清洗仪内超声20min后冻存于-20℃冰箱，如此反复三次后取20μl加入2*还原型上样缓冲液20μl，混匀沸水水浴十分钟，上样10ul每孔。 发酵离心菌体，发酵下罐离心菌体： 离心后的发酵液，加入原始体积7倍的PH7.4的PBS溶解，超声破碎仪内超声10min（超声一秒停顿五秒）后，取20μl加入2*还原型上样缓冲液20μl，混匀沸水水浴十分钟，上样10ul每孔。 下罐离心菌体： 离心后的菌体，于电子天平内精密称量0.1±0.01g,加入3.5ml的PH7.4的PBS溶解，超声破碎仪内超声10min（超声一秒停顿五秒）后，取20μl加入2*还原型上样缓冲液20μl，混匀沸水水浴十分钟，上样10ul每孔。 包涵体，洗涤包涵体： 于电子天平