一株高产胞外蛋白酶菌株的选育.docx

一株高产胞外蛋白酶菌株的选育摘要：本实验采用的菌株来源于XXX大学动科院养牛场中的土壤，通过设置不同的培养基来筛选具有产胞外蛋白酶能力的菌株。以酪素培养基平板产生的透明圈的直径/菌落直径的大小作为选择标记，经初筛选择出比值大的菌株为出发菌株。经紫外线诱变处理，培养获得两种未知高产胞外蛋白酶菌株。对其进行形态观察和生理生化鉴定，结果表明突变菌株w1的形态、生理生化特性符合芽孢杆菌属的特征，而突变菌株w2为革兰氏阴性杆菌。关键字：细菌；胞外蛋白酶；筛选 ；鉴定蛋白酶（Protease）是催化蛋白质水解的一类酶，微生物蛋白酶主要由霉菌、细菌生产。蛋白酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键。该酶催化反应速度较快，无工业污染，且反应条件适应性宽，被广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。目前微生物菌种选育所采用的诱变手段主要有激光诱变、DES诱变结合热处理、空间诱变、紫外线照射和亚硝基胍复合诱变等。蛋白酶分布广，主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物中含量丰富。由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备。常见的能产生蛋白酶的蛋白微生物有细菌中的酸性蛋白酶生产菌（如黑曲霉、根霉）；碱性蛋白酶生产菌（如地衣芽孢杆菌）；中性蛋白酶生产菌（如枯草芽孢杆菌）。本实验以养牛场土壤中筛选得到的蛋白酶生产菌株为出发菌株，采用紫外线照射诱变方法育种，以筛选得到高产胞外蛋白酶菌株。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 土样：河北农业大学西校区养牛场中的土壤1.1.2 培养基：（表中数据均为1000mL培养基中所含物质量）筛选培养基：酪素培养基干酪素酵母膏甘油dH2OK2HPO4琼脂pH1g0.25g1.25g250mL0.125g4g8.0营养培养基：肉汤培养基蛋白胨牛肉膏NaClH2OpH10g3g5g1000mL7.4鉴别性培养基淀粉培养基蛋白胨NaCl牛肉膏可溶性淀粉dH2O琼脂10g5g5g2g1000mL16g明胶培养基蛋白胨牛肉膏明胶dH2OpH5g13g120g1000mL7.2—7.4葡萄糖发酵培养基蛋白胨NaClK2HPO4dH2O1.6%溴甲酚紫pH10g5g0.2g1000mL1—2mL7.2—7.4葡萄糖蛋白胨培养基蛋白胨葡萄糖K2PO4dH2OpH5g5g2g1000mL7.2—7.4乳糖发酵培养基（已配好）柠檬酸盐培养基（已配好）半固体培养基（已配好）三糖铁培养基（已配好）1.2 方法1.2.1 菌种的筛选1.2.1.1 培养基的配置及灭菌按上述方法分别配置肉汤培养基和酵素培养基，配置完成后放入高压灭菌锅于120℃下灭菌20min。取6只试管，分别加入9mL蒸馏水，向试管中加入10个玻璃珠，盖好胶塞，进行灭菌。1.2.1.2 涂布分离称取9g土样，放入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分震荡5~8min，静置10min。取1mL上清液进行逐步稀释，分别稀释到浓度为10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7。在酒精灯附近进行无菌操作，取10-5,10-6,10-7三个浓度梯度的稀释液各100μL于无菌的酪素培养基平板上进行涂布。每个浓度梯度下设置两个平板。待培养基凝固后贴好标签，在30℃的培养箱中倒置培养6d。1.2.1.3 菌种的纯化观察平板上菌落的形态特征，挑选出具有透明圈的菌落，用直尺测量其菌落直径C和透明圈直径H，从中选出两个H/C较大的菌落进行接种。采用分区划线法在酪素平板上对菌株进行分离纯化。每次都从上一次划线的末端开始划起，保证菌落被逐步稀释，最后得到单个菌株。将纯化的菌株接种盛有肉汤培养基中的锥形瓶中，在37℃条件下振荡培养。1.2.2 紫外线诱变育种1.2.2.1 悬浮液的制备用移液器吸取1mL肉汤培养基，加入到Ep管中，在12000r/min的条件下离心2min；去上清液，加入1mLH2O使其悬浮，再次离心并去上清，重复三次。将12个Ep管中的悬浮液加入平皿中混匀。1.2.2.2 紫外诱变取培养皿中溶液1mL，作为对照组，不做任何处理。其他在紫外光下分别照射30 ,130 和2。照射后分别取1mL按以下方法进行梯度稀释（此项操作在黑暗处进行）：照射时间浓度梯度0： 10-1，10-2，10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-83： 10-1，10-2，10-3,10-4,10-5,10-61： 10-1，10-2，10-3,10-4,10-5,10-6130： 10-1，10-2，10-3,10-4,10-5,10-62： 10-1，10-2，10-3,10-4,10-5,10-6稀释完成后，取后三个梯度各0.1mL进行涂