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Western blot 实验技术 定义 　　　蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现己广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 基本原理 Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 Western Blot显色的方法 一、放射自显影 二、底物化学发光ECL 三、 底物荧光ECF 四、底物DAB呈色 一般流程 蛋白质样品的制备 底物显色 转膜 一抗杂交 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 二抗杂交 封闭 Western blot的常见问题 1.胶不平： 原因：1.1玻板洗刷不干净。 1.2 加入合适的TEMED后未充分混匀，导致部分胶块聚合不均匀。 2.在灌胶时 应沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡，加水液封时要慢，否则胶会冲变型。 3.拔梳子时应垂直向上拔起，用力均匀。 4.微笑或倒微笑 原因: 胶板底部有气泡，会影响电泳效果，应赶走气泡，采用的方法是预电泳55V,半小时。 5.凝胶肿胀或卷曲 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min. 6.在转膜过程中会产热，因为缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。所以应放置冰块降温。 7.背景太深： 原因： 7.1 膜没有充分浸湿 7.2膜或缓冲液污染 7.3封闭液封闭不完全 7.4 抗体浓度过高 ELISA试剂盒 ELISA检测原理 酶联免疫吸附测定的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。在测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。 ELISA 制备 方法 抗原表位的计算机筛选 血清的采集 间接ELISA方法的敏感性和特异性验证 试剂盒的稳定性验证 间接ELISA方法的建立 抗原的制备 对屠宰场进行临床检测 ELISA试剂盒的优点 一、高效、灵敏、特异的抗体； 二、稳定的重复性和可靠性； 三、吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相载体； 四、适用血清、血浆、组织匀浆液、细胞培养上清液、尿液等等多种标本类型； 五、节省实验经费。 ELISA法在生物医学领域的应用可分为 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。