细菌内毒素检查SOP.doc

细菌内毒素检查SOP 文件编码 JK1302·019-04 Copy № 变更原因： 进一步完善该操作规程内容，使其更加具有操作性。 起 草 日 期： 年 月 日 核 日 期： 年 月 日 准 日 期 年 月 日 年 月 日 字 变更记载 分发单位 适用范围 本标准适用于细菌内毒素的检查。 职责 QC负责人 监督检验员按SOP检查 检验员 严格该SOP检查 内容 原理 用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定，内毒素的量用内毒素的单位(EU)来表示。 实验材料及用具 3.2.1.电热干燥箱温度应能达到250℃。 3.2.2. 恒温水浴箱（37±1℃）。 3.2.3.温度计，精度在1℃以下。 3.2.4. 旋涡混合器。 3.2.5. 鲎试剂应具有国家主管部门批准文号。 3.2.6. 细菌内毒素工作标准品，应使用中国药品生物制品检定所统一发放的标准品。 3.2.7. 细菌内毒素检查用水（含内毒素小于0.015EU的灭菌注射用水）。 3.3.准备工作 3.3.1.试验所用器皿，250℃干烘至少≥60分钟。 3.3.2.鲎试剂灵敏度复核，按《中国药典》2005版三部287页进行。 3.3.3.供试品干扰试验， 按《中国药典》2005版三部287页进行。 3.4.操作方法 3.4.1. 试验准备 将试验所用器皿用洗涤剂和自来水洗净除去水分后置洗液中浸泡4小时，取出将洗液滤干，用自来水将残余洗液洗净，在用新鲜蒸馏水冲洗干燥后，用锡箔纸密闭玻璃器皿口，放置适宜的密闭金属容器中，置烤箱中在250℃干烤至少1小时，容器在不打开包装的情况下可在一周内使用，否则须再加热除去热源。 3.4.2.内毒素标准溶液的制备 3.4.2.1. 取细菌内毒素工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用75%酒精棉球擦拭后开启，防止玻屑落入瓶内。 3.4.2.2. 按使用说明书用移液管加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严。置旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成所需浓度的细菌内毒素标准品溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒。 3.4.3. 供试品溶液的制备 3.4.3.1 供试品最大有效稀释倍数的计算： MVD= L为供试品的细菌内毒素限值； 为使用鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）； C为供试品的浓度，当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml。 3.4.4.鲎试剂的制备 取0.1ml/支的鲎试剂8支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用75%酒精棉球擦拭后开启，防止玻璃屑落入瓶内，加入0.1ml的细菌内毒素检查用水复溶，轻 轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。 3.4.5.细菌内毒素稀释法 3.4.5.1.阳性对照溶液的制备 用细菌内毒素检查用水将内毒素标准品稀释成2浓度的内毒素溶液。 如细菌内毒素规格为5EU/ml，检品细菌内毒素限量应小于0.25EU, 鲎试剂灵敏度0.25EU/1ml，规格0.1ml, 细菌内毒素应稀释成0.5EU/ml（2浓度）。 3.4.5.2.供试品阳性对照溶液的制备 用供试品液将内毒素标准品制成2浓度的内毒素。 3.5.凝胶法 3.5.1. 原理：通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 3.5.2.方法：取复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原装安瓿8支，其中2支加入0.1ml按最大有效稀释倍数稀释的供试品溶液作为供试品管，2支加入0.1ml用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素标准品制成的2浓度的内毒素溶液作为阳性对照管，2支加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照管，2支加入0.1ml供试品阳性对照溶液(用被测供试品或供试品的最大有效稀释液制成2.0的内毒素液)作为供试品阳性对照管。将安瓿中溶液轻轻混匀后，用封闭管口，垂直放入37±1℃水浴中，保温60分钟±2分钟。保温和拿取过程应避免受到振动，造成假阴性结果。 凝胶限量试验溶液的制备 编号 内毒素浓度/配制内毒素的溶液 平行管数 A 供试品溶液 2 B 2λ/供试品溶液 2 C 2λ/检查用水 2 D 检查用水 2 注：A为供试品溶液；B为供试品阳性对照；C为阳性对照；D为阴性对照 结果判断 保温60分钟±2分钟后观察结果。从水浴中轻轻取出安瓿，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性(+)，未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性(-)。保温和拿取安瓿过程中应避免受到震动造成假阴性。若阴性对照溶液D的平行管