中医不同治法拮抗大鼠IRI心肌细胞凋亡分子机制探究.doc

中医不同治法拮抗大鼠IRI心肌细胞凋亡分子机制探究【摘要】 目的 观察中医不同治法（补气、活血、化痰）对大鼠心肌缺血再灌注（I/R）诱导细胞凋亡及Caspase-3和NF-κB表达的影响。方法 建立大鼠动脉粥样硬化在体心肌缺血再灌注模型，采用原位末端TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数（AI），免疫组化、ESMA法观察心肌细胞Caspase-3及NF-κB因子表达。结果 中医不同治法（补气、活血、化痰）均能降低AI；补气法、活血法能够抑制Caspase-3及NF-κB的表达，而化痰法对以上因子的表达无明显影响。结论 中医不同治法（补气、活血、化痰）可能通过不同途径抑制I/R心肌细胞发生凋亡，从而对I/R心肌具有保护作用。? 【关键词】 补气法； 活血法； 化痰法； 心肌缺血再灌注损伤； 细胞凋亡； Caspase-3; NF-κB ?? 心血管疾病常发生缺血再灌注损伤，其机制可能是一种多因素参与的复杂病理生理过程，涉及到多个环节。但无论由哪种途径引起的心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)，最终均可导致心肌细胞结构的改变和破坏。为此，笔者在动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）大鼠MIRI模型上，观察中医补气、活血、化痰不同治法对大鼠心肌缺血再灌注后心肌超微结构影响，并观察Caspase-3及NF-κB的表达，从分子水平探讨补气、活血、化痰不同中医治法拮抗MIRI细胞凋亡机理的异同，以期更加客观和直接地揭示中医不同治法的心肌保护效应，为进一步临床应用提供依据。? 1 材料与方法? 1.1 主要药物与试剂? 1.1.1 药物制备给药剂量和给药方式 保元汤、血府逐瘀汤、瓜蒌薤白半夏汤水煎剂按照参考文献［1］制备；保元汤以成人等效量0.95 g生药/kg体重灌胃，血府逐瘀汤以成人等效量1.37 g生药/kg体重灌胃，瓜蒌薤白半夏汤以成人等效量0.59 g生药/kg体重灌胃，给药体积均按1 ml/100 g计算，于缺血再灌注前30 min给大鼠灌胃，缺血再灌注组注入等量生理盐水。? 1.1.2 试剂 原位细胞凋亡检测试剂盒、鼠抗Caspase-3单克隆抗体以购自美国sigma公司，NF-κB P65抗体(一抗)和Western blot luminol reagent购自美国satus cruzs公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(二抗)购自北京中山公司;T4多核苷酸激酶和NF-κB探针购自美国Promega公司；［r-32p］ATP购自北京亚辉公司。? 1.2 动物模型制备及分组 健康雄性wistar大鼠50只，体重250～300 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。参照参考文献［2］的方法，制备高脂乳剂，按10 ml/kg灌胃，每日1次，连续12周，造成大鼠AS模型。随机分成5组，即假手术组（sham组）、IRI模型组(I/R组)、补气法组（BQ组）、活血法组（HX组）、化痰法组（HT组），每组10只动物。? 在大鼠AS模型的基础上，手术建立大鼠MIRI模型：大鼠称重后氯胺酮80 mg/kg经腹腔注射麻醉。气管切开接呼吸机人工呼吸，记录Ⅱ导联心电图。开胸后以左冠状静脉主干为标志结扎左冠状动脉。以心电图ST段明显抬高、结扎点远端心肌发绀为结扎成功标志。结扎冠状动脉左前降支30 min，复流3 h。sham组只穿线不结扎冠脉。? 1.3 检测指标与方法? 1.3.1 心肌凋亡细胞原位检测 采用末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)介导的dUTP-生物素平移末端标记技术-TUNEL法(TdT-mediated dUTP end labeling)标记凋亡心肌细胞。按试剂盒说明书进行。TUNEL阳性反应为核呈棕褐色或棕黄色颗粒。核呈TUNEL阳性反应且具备细胞凋亡的形态学特征者被判定为凋亡细胞。在每张玻片上随机取4个高倍视野(400×)，计数每个视野凋亡细胞总数，并计算凋亡指数(Apoptosis Index，AI)。? 1.3.2 Caspase-3表达检测 二步法免疫组化法测定，参照试剂盒说明操作，1∶50稀释，兔二步法检测试剂盒(PV-6001)购自北京中杉公司，胞浆或胞核显示黄棕色颗粒为染色阳性。? 1.3.3 NF-κB表达检测 凝胶电泳迁移率(EMSA)法定：称取各组心肌组织0.1 g经匀浆离心后取上清液，考马斯亮蓝G-250测核蛋白浓度，并调整核蛋白浓度为1 μg/μL,置于-70℃保存备用。用T4多核苷酸激酶和［r-32p］ATP对寡核苷酸NF-kB探针进行末端标记，与提取的核蛋白进行结合反应。反应液经7%非解离聚丙烯酰胺凝胶电泳，最后放射自显影。用分析软件以