丹参13C-NMR指纹图谱探究.doc

丹参13C-NMR指纹图谱探究(1.山东省分析测试中心，山东 济南 250014；2.山东省科学院生物研究所，山东 济南 250014)?? 摘 要：目的：利用傅立叶变换核磁共振波谱仪测定不同产地丹参提取物的??13C-NMR图谱，建立鉴别丹参药材真伪优劣的核磁共振指纹图谱分析。方法：对丹参提取物的??13C-NMR指纹图谱进行解析；并与其活性成分丹参酮IIA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和二氢丹参酮进行??13C-NMR谱图的比较与指认；获得了两种丹参伪品??13C-NMR谱图，并与丹参特征提取物谱图进行相似度分析。结果：相似度分析处理结果表明，利用NMR指纹图谱能快速确定丹参药材的真伪优劣。结论：该方法操作简单、快捷、可靠，可以作为丹参药材真伪鉴别的依据。? 关键词：??13C-NMR；指纹图谱；丹参；鉴别? 中图分类号：R284.1文献标识码：A文章编号：1673-2197（2008）10-0021-02? 丹参为唇形科植物Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。始载于《神农本草经》，列为上品。主产我国的四川、河北、安徽等省，有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦之功效［1］。现代临床上主要用于加强心肌收缩力以及促进组织的修复与再生等。丹参是最为广泛应用的中药材之一。有报道其伪品为旋花科植物甘薯Ipomoea batatas(L)La的干燥须根，经染色后的加工品及中药续断等。为此本篇以不同产地丹参的特征提取物为研究对象，以核磁共振作为主要研究手段，对获取的丹参13C-NMR指纹图谱进行相似度分析，以此作为控制丹参药材质量的标准。? 1 仪器与试药? 仪器：Varian INOVA 600型超导傅立叶变换核磁共振波谱仪。试药：乙醇为分析醇，蒸馏水；丹参及甘薯的干燥须根，丹参伪品续断购自山东临沂、蒙阴、莒县、安徽、河北等地，由山东省分析测试中心王晓研究员鉴定；丹参酮IIA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、二氢丹参酮对照品由山东省分析测试中心提供。? 2 实验方法? 2.1 样品的制备? 取丹参各产地样品5g，加90%乙醇25mL，超声提取45min［2，3］，滤取提取液，将溶剂挥干，取一定量残余物备用。? 2.2 实验条件? 丹参酮IIA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、二氢丹参酮和丹参及其伪品提取物的??13C-NMR指纹图谱用Varian INOVA 600型超导傅立叶变换核磁共振波谱仪在25℃测定，扫描次数分别为10000次，以CDCl3-d 做溶剂，TMS为内标。? 2.3 精密度实验? (1)仪器精密度：将约5mg丹参酮IIA用CDCl3-d，在上述实验条件下重复测定??13C-NMR六次，计算丹参酮IIA中17位甲基碳信号化学位移的RSD为2.1%? (2)方法精密度：将丹参提取物1号约5mg在上述实验条件下重复测定??13C-NMR六次，计算丹参酮IIA中17位甲基碳信号化学位移的RSD为3.2%? 2.4 稳定性实验? 将丹参提取物1号在0、2、4、6、8及24h时测定，计算丹参酮IIA中17位甲基碳信号化学位移的RSD为3.4%，结果表明，丹参供试品常温下24h保持稳定。? 2.5 样品NMR指纹图谱的测定? 将各批次丹参样品及伪品按2.1所述方法进行制备并测定其??13C-NMR指纹图谱。典型指纹图谱见图1。? 图1 1号丹参样品的??13C-NMR核磁共振指纹图谱 3 相似度分析? 根据专家的形态学鉴定结果，首先选取1号野生丹参药材测定指纹图谱，并以其指纹图谱为参照，以向量夹角法为测度，进行相似度分析。向量夹角法是以N 个数值组成的行( x?1， x?2， x?3，…，x?n ) 称为N维向量，简记为大写字母X， 定义|X|=x??2??1+x??2??2+x??2??3+…+x?2?n为向量X 的模。如果存在两个向量X 及Y 则称为X 与Y 的内积，X、 Y 之间的向量夹角按照下面公式计算。如果cosθ越接近1则说明两个向量越相似［4］。? cosθ=X#8226;Y|X|×|Y|? 每个NMR指纹图谱都可以看作一组对应化学位移的峰高(或峰面积)的数值，可将这组数值看作多维空间中的向量，使两个指纹图谱间相似性的问题转化为多维空间的两个向量的相似性问题，利用上面公式计算cosθ来定量表 征指纹图谱间的相似性。cosθ值大于0.85为推荐药材，小于0.85为不推荐药材或其它种属药材。相似度分析结果见表1。? 4.1 丹参中功效成分的??13C-NMR谱分析? 丹参的主要功效成分为丹参酮类化合物等，见图2、表2。因此获得丹参中丹参酮IIA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和二氢丹参酮的