姚敏杰基于磁性微粒和荧光微球的dna检测方法研究(西北大学硕士学位答辩)2007.6.ppt

西北大学硕士学位论文 西北大学硕士学位论文 * * 西北大学硕士学位论文答辩 基于磁性微粒和荧光微球的DNA 检测方法研究 答辩人：姚敏杰 专 业：分子微生物学 导 师：陈 超 教授 崔亚丽 教授 西北大学生命科学学院 2007-05 西北大学硕士学位论文答辩 目录 综述 研究报告 实验一 基于磁性微粒的DNA杂交检测 实验二 荧光微球用于人乳头瘤病毒的基 因分型研究 全文总结 目前现有的固相核酸杂交检测方法 杂交基本原理 本研究的意义 西北大学硕士学位论文答辩 1.目前现有的固相核酸杂交检测方法 综述 特异性、敏感性、样品制备和标记繁琐、仪器的研制和机械化程度不高 大规模、高通量 快速、自动化程度高 DNA芯片技术 敏感性较低 特异性好 bDNA技术 工作量大，实际应用受到限制 假阳性率较低 差异杂交 灵敏度低，操作繁琐复杂 特异性强 印迹杂交 不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 操作简单，事先无需对核酸样品进行特殊处理，一张膜可同时检测多个样品 斑点杂交/狭线杂交 组织原位杂交 操作繁琐，费时耗力 特异性高，可精确定位 菌落原位杂交 原位杂交 缺点 优点 方法种类 西北大学硕士学位论文答辩 磁性微粒技术 磁性微粒的研究始于上世纪70年代，它除具有纳米颗粒的特征外，还可以通过表面的功能基团进行修饰，共价偶联蛋白、核酸等有机/生物分子， 并且具有顺磁性，可在外加磁场的作用下快速移动和分离而广泛应用于免疫学检测、靶向载药、细胞分选、酶的固定化以及分子生物学（DNA和RNA的测序与纯化）等领域中。 技术优势 灵敏度高、特异性强 实用性、操作性强 仪器设备简单、省时省力 西北大学硕士学位论文答辩 荧光微球技术 液态悬浮芯片技术是指一项将核苷酸、抗原、抗体、受体、肽链及酶底物等生物大分子结合在荧光微球表面，根据生物测定的原理，与待测样品中的相应物质发生特异性反应，然后借助流式细胞仪对检测结果进行实时定量化分析的技术。 技术优势 高通量、快速分析 高特异性、高精确性、高灵敏度 省时、省力、经济 液态悬浮基因芯片仪器照片 西北大学硕士学位论文答辩 2.杂交基本原理 固相直接杂交检测原理示意图 RNA DNA 后续检测 后续检测 标记检测探针 固相基质 固相基质 标记物 西北大学硕士学位论文 单碱基链延伸反应检测SNP基因型的示意图 5’ 3’ + 5’ 3’ 后续检测 分别代表不同的碱基 标记物 图解 单碱基链延伸反应的原理 引物 西北大学硕士学位论文答辩 本研究的意义 有助于建立经济、快速的DNA固相检测方法 有助于高通量、高灵敏度、高特异性和自动化的DNA 检测方法的建立 有助于对遗传疾病、肿瘤、传染病等的迅速诊断，有 助于司法部门对罪犯的鉴别、性别鉴别、器官或组织 移植的配型等领域的研究与应用 西北大学硕士学位论文答辩 实验一 基于磁性微粒的DNA杂交检测 实验原理 探针与磁性微粒的偶联 靶片段的扩增 单碱基链延伸 荧光信号的引入以及结果的读取 实验小结 研究报告 西北大学硕士学位论文 检测原理示意图 实验原理 A：jingwen Chen 等检测SNP原理示意图[1] B：本研究设计原理示意图 [1] jing wen Chen, Marie A. lannone et al. A Microsphere-Based Assay for Multiplexed Single Nucleotide Polymorphism Analysis Using Single Base Chain Extension [J].Genome Research.2000,10:549-557 西北大学硕士学位论文 探针与磁性微粒的偶联 探针在不同磁性微粒表面的偶联示意图 苯异二硫氰酸酯 丙基三甲氧基硅烷 A B C A：羧基末端磁性微粒 B：氨基末端磁性微粒 C：环氧乙烷磁性微粒 西北大学硕士学位论文答辩 磁性微粒的优选 磁性微粒的种类 羧基末端磁性微粒、氨基末端磁性微粒、环氧乙烷磁性微粒、Dynal磁性微粒 优选内容 探针在磁性微粒表面最大偶联量 探针在磁性微粒表面的偶联效率 经过热处理后探针在磁性微粒表面的损失量 探针在磁性微粒表面偶联所用时间 选用材料的价格 96℃ 5 min 5 min+5个循环 5 min+10个循环 5 min+20个循环 5 min+30个循环 西北大学硕士学位论文 磁性微粒优选结果 1.最大偶联量和偶联效率 1.5 mg 磁性微粒加入量(mg) 97.60±0.01 97.