原位杂交生物信息分析等生物技术.ppt

生物信息学 流感先心病组—唐超 2010年12月19 应用生物信息学解决 科研问题的常规思路 1 思考所要分析的内容 2 查找能够解决此类问题的软件或者网站 3 熟悉软件和网站的使用 4 通过对比分析,在多款软件和网站中得出 你所需要的软件或者网站 5 运用该软件或者网站解决科研问题 NCBI：National Center for Biotechnology Information NCBI(美国国立生物技术信息中心)理解自然无声但精妙的关于生命细胞的语言是现代分子生物学的要求。通过只有四个字母来代表DNA化学亚基的字母表，出现了生命过程的语法，其最复杂形式就是人类。阐明和使用这些字母来组成新的“单词和短语”是分子生物学领域的中心焦点。数目巨大的分子数据和这些数据的隐秘而精细的模式使得计算机化的数据库和分析方法成为绝对的必须。挑战在于发现新的手段去处理这些数据的容量和复杂性，并且为研究人员提供更好的便利来获得分析和计算的工具，以便推动对我们遗传之物和其在健康和疾病中角色的理解。 一、查找并下载文献 二、查找目的基因 三、根据目的基因设计引物 四、测序后序列对比 关于可查找各种信号通路图的３个国外网站 /genes/index.asp/index.asp?http://www.genome.ad.jp/kegg/  蛋白质功能分析及预测 结构域分析 Smart http://smart.embl-heidelberg.de/ 亚细胞定位预测：/ 磷酸化位点预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/ 跨膜区预测：/software/TMPRED_form.html 分子量等电点预测：/calc_mw_pi.html 信号肽预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ 二级结构预测：http://www.jensmeiler.de/jufo.html 网站和软件推荐 /cgibin/primer3/primer3_www.cgi在线引物设计 / 丁香园 / 中国医学生物信息网 / 生物谷 /down_index.html 中生网 / 生物通 原位杂交 原理： 原位杂交（in situ hybridization）是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在核酸原有的位置进行细胞定位。 胚胎从小鼠体内取出来之后 1、在新鲜的用PBS配置的4%的多聚甲醛（PH=7.4）中于4° C固定过夜。 2、将胚胎放在PBT中洗5分钟，室温慢慢摇晃 3、在用PBT配置而成的25%, 50%, 75%，100%的甲醇溶液梯度中脱水每次5分钟，室温慢慢摇晃（胚胎大一点可适当延长时间） 4、100%的甲醇-20度保存。（最多保存6个月） 染色质免疫共沉淀（CHIP） 原理：是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 应用 1、CHIP可以检测体内反式因子与DNA的动态作用 2、可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系 3、CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围： CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选。 CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点 RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。 一般ChIP的流程 ： 甲醛处理细胞---收集细胞，超声破碎---加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合---洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联，纯化富集的DNA-片断---PCR分析。 对人体无害，易检测，敏感性好，可以在-20度长期保存 简单，特异性好 无污染，可以在-20度长期保存 便宜 优点 带有碱性磷酸酶标记的dig抗体检测，最后通过显色剂显色。 在荧光显微镜下观察 与抗生素蛋白(avidin)结合 放射自显影 检测方法 昂贵 受时间的限制 灵敏度不是很高 污染环境，对人体有害 受半衰期限制，检测周期长 缺点 标记在UTP上，通过PCR法