基因芯片系统09.03.06.ppt

大型仪器分析在生命科学研究中的应用 刘国元 2009-03-06 授课内容 第一部分：生物芯片简介 第二部分：基因芯片概述 第三部分：基因芯片相关技术及流程 第四部分：Affymetrix 基因芯片操作平台 第五部分：基因芯片的应用 一、生物芯片 借用了计算机芯片的集成化的特点，把生物活性大分子，密集排列固定在固相载体上，形成微型的检测器件 固相载体通常是硅片、玻片、聚丙烯或尼龙膜等 包括cDNA、寡核苷酸、蛋白质、细胞和组织微阵列 生物芯片特点 在面积不大的基片上有序地点阵排列一系列固定于一定位置、可寻址和识别的生物分子 微电子学的并行处理和高密度集成的特点，可对生物分子进行快速并行处理 高通量，高信息量、快速、自动化 二、基因芯片概述 越来越多的动植物、微生物基因组序列得到测定 GenBank数据库中已含有300万个序列，总数超过22亿个碱基对，其中包括19种不同生物体的完整序列、近9 000个已知功能或已推测功能的人类基因序列 基因序列数据库正在以前所未有的速度迅速增长 如何充分利用新序列信息资源，怎样去研究如此众多基因的生物信息及其在生命过程中所担负的功能，成为生命科学工作者的共同课题 传统分析和高通量分析的比较 80年代初期，有人曾设想利用计算机半导体技术生产基因芯片以对人类基因大量的遗传信息进行分析和检查。 直到1994 年Pease等人创造的光导原位合成高密、微化的寡核苷酸阵列(ODTA)的制作技术问世之后，才使该设想逐步成为现实。 光导ODTA化学合成法为基因芯片技术奠定了基础 现在全世界已有十多家公司从事基因芯片研究和开发工作，而且已有较为成型的产品和设备问世。这些公司主要以美国的Affymetrix公司为代表。 基因芯片发展历史 基因芯片（DNA芯片）定义 将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上 与待测的标记样品按碱基配对原理进行杂交 激光共聚焦荧光检测系统等检测系统对其进行扫描 相应软件对信号进行比较和检测，得到所需的大量信息 基因的高通量、大规模、平行化、集约化的信息处理和功能研究 基因芯片原理示意图 三、基因芯片相关技术及流程 基因芯片制备技术 靶基因的制备 杂交和检测 杂交图像分析 …… 原位合成 直接在芯片上用四种核苷酸合成所需的探针 光蚀保护 Affymetrix Ink-jet Agilent 合成点样 将已经合成好的探针定位在芯片上 接触式和非接触式 cDNA PCR 产物 Oligo 原位光刻合成 由美国Affymetrix公司开发 把玻璃基片上的活性羟基修饰上光保护基团，此光保护基团可被一定波长的光激活并脱保护。 根据所要制作的阵列的需要设计光刻掩膜。将掩膜（M1）覆盖在修饰过的基片上，用光照射使曝光区域的基片表面脱除保护基团而形成活性羟基（1-2）。 引入5`端被X基团保护、3`端被活化的单核苷酸dNTP，使dNTP的3`端与基片上的活性羟基缩合，洗去未有效结合的dNTP（3）。 更换掩膜M2，重复1-2，直到所需要的探针阵列合成完毕（4-6）。 特异性的提高 相比cDNA芯片和单一序列的寡核苷酸芯片，多个短的探针片段可以有效的区分有同源性的基因序列，克服了背景噪声、错误和偏差。避免了同源性靶序列与探针交叉杂交，而引起的假阳性和判断错误。 25mer长度的寡核苷酸的信号强度和分辨率达到了一个平衡，在这个长度下，有一个碱基发生错配，杂交复合物就会变得很不稳定。如果长度达到60mer，就无法区分序列上十分接近的序列了 从多个探针位点检测的荧光信号，经过综合评估、统计计算和分析，获得的数据比单个探针判断样品是否存在某一靶序列的数据更为可靠 灵敏度的提高 定量精确、重复性好 不同芯片间、不同批次样品间实验结果吻合很好，保证了多张芯片间的比较的有效、可靠性 基因芯片流程 芯片制备 (生物学问题的提出和芯片设计) 样品制备 (探针标记) 样品与探针的杂交反应 信号检测 结果分析 (数据处理和建模) DNA样品制备 样品来源: 从细胞中提取 mRNA后转录成cDNA；各种基因组DNA等。 探针在与芯片靶基因结合杂交之前必需进行分离、扩增及标记. 标记方法根据样品来源、芯片类型和研究目的的不同而有所差异. 通常是在待测样品的PCR扩增、逆转录或体外转录过程中实现对探针的标记. 杂交反应 标记的样品与芯片上的靶基因进行杂交, 产生检测信号的过程. 杂交反应的条件要根据靶基因或探针的长度、标记元素种类及芯片的类型来优化. 合适的杂交条件可使生物分子间的反应处于最佳状态, 增强其检测的灵敏度, 减少错配率, 提高信噪比. 信号检测结果分析 芯片经杂交反应后, 各反应点形