SssI甲基化酶.PPT

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 第二节 甲基化酶 Methylase Methylation methyltransferase 原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员， 用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。 一、DNA甲基化酶 甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序。甲基化酶使识别顺序中的某个碱基发生甲基化，保护DNA不被限制性内切酶切开。 真核生物中目前只发现5-甲基胞嘧啶（M5C）。M5C占整个胞嘧啶中的2～7%（果蝇和某些昆虫例外）。M5C大多以M5CpG的形式存在，不同物种或同一物种的不同组织中，M5C出现的频率也不尽相同。 将限制性内切酶和甲基化酶同时作用，可使有几种可能识别顺序的限制性内切酶只对其中一种识别顺序有效。 例如限制性内切酶AvaⅠ的识别顺序是： 5’……CPyCGPuG……3’ 3’……GPuGCPyC……5’ Py可以是任何一种嘧啶，pu可以是任何一种嘌呤。因此可以有4种识别顺序。如果同时使用甲基化酶TaqⅠ和甲基化酶HpaⅡ，则AvaⅠ的识别顺序将只是5’……CCCGAG……3’。 如果有一个DNA片段，有AvaⅠ的3个识别顺序，当用AvaⅠ处理后可得4个片段。可是，如果先用TaqⅠ甲基化酶和HpaⅡ甲基化酶使DNA顺序中的有些碱基甲基化，然后再用AvaⅠ去切，结果只有1个识别顺序可被AvaⅠ作用，只产生2个DNA片段。 二、甲基化酶的种类 在真核和原核生物中存在大量的甲基化酶， 在E.coli中大多数都有三个位点特异性的DNA甲基化酶 Dam甲基化酶 DNA Adenine methylase GATC 腺嘌呤N6位置 引入甲基 PvuII BamHI BclI BglII XhoII MboI Sau3AI 识别位点中含GATC序列 ClaI(1/4) XbaI (1/16) TaqI (1/16) MboII (1/16) HphI(1/16) 部分识别序列含GATC序列 4个ClaI位点(ATCGATN)中有一个该序列 有些限制酶对Dam甲基化敏感 不能切割相应的序列 如:BclI, ClaI, MboI, XbaI 等这;甲基化敏感的限制性内切酶. 不敏感的有 BamHI, Sau3AI, BglII, PvuI等. MboⅠ 和 Sau3AⅠ 识别和切割位点相同，但其差异就在于前者对甲基化敏感。 一般哺乳动物DNA 不会在A-N6上甲基化 当需要在敏感位点上完全切割DNA时，必须从dam- E.coli中提取DNA Dcm甲基化酶 DNA cytsine methylase 识别CCAGG或CCTGG序列 在第二个C上C5位置上引入甲基 EcoRII / BstNI CCA(T)GG 二者识别序列相同，但切点不同 EcoRII受dcm甲基化作用影响 BstNI可避免这一影响 受影响酶有： Acc65I GGTACC AlwNI ApaI GGGCCC EcoRII EaeI 等 不受影响酶有： KpnI GGTACC BanII Bg1I BstNI NarI GGCGCC 等 3. EcoKI甲基化酶 识别AAC(N)6GTGC TTG(N)6CACG A N6位置 但识别位点少(1/8kb) 研究较少 而dam（1/256bp） dcm(1/512bp) 4. SssI甲基化酶 来自原核生物Spiroplasma CG序列中的C在C5位置上甲基化 可在未甲基化或半甲基化链上起作用 许多酶对此甲基化敏感 AatII ClaI XhoI SalI等 不敏感的有BamHI EcoRI SphI KpnI SssI甲基化的DNA 受E.coli McrA, McrBC, Mrr 系统的限制 5. 其它甲基化酶 DNMT1 1988年克隆出的真核生物的甲基转移酶. 具有催化作用的c端和调节功能的N端. 三、依赖于甲基化的限制系统 E.coli中至少有3种依赖于甲基化的限制系统 它们识别的序列各不相同， 但只识别经过甲基化的序列 依赖于甲基化的内切酶 mcrA, mcrBC, mrr 都限制由 CG甲基化酶(MSssI)作用的DNA Mrr也限制m6A McrBC 切割两套位点（G/A）mC，这两套位点之间间隔2kb，最适为55～103