中外奶粉检验标准及方法.ppt

蛋白质分析在实际中的应用;有关事件;有关事件;现状与结果;现状和结果;现状与结果;解决办法——检测;解决办法——检测;解决办法——检测;解决办法——检测;解决办法——检测;解决办法——检测;1凯氏定氮法;2.分光光度法;三聚氰胺的检测 此次新颁布的国家标准中，规定了三种用于对原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定量测定方法，即高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱/质谱法，以及三种方法的检测定量限（分别为2毫克/千克、0.05毫克/千克和0.01毫克/千克）。;HPLC 凝胶过滤色谱法测定牛奶及其乳制品中的A-乳白蛋白和B-乳球蛋白;1 材料与方法 1. 1 材料与试剂 奶粉和液态奶由当地超市购得, 包括3 种婴幼儿奶粉( 编号分别为Y1, Y2, Y3) 、4 种液态乳清饮料( 编号分别为UHT1, UHT2, UHTR1, UHTR2) , 原料奶来自当地奶牛场.A- La( lot L- 5385 type I, 纯度\85 % ) 和BLg( lot L-2506, 纯度\80 % ) 等牛奶蛋白标准品购自Sigma公司, 盐酸胍、B-巯基乙醇购自天津光复精细化工研究所.KH2PO4,Na2HPO4#12H2O, NaH2PO4#2H2O, EDTANa2( 2H2O) , NaCl 和NaN3 购自天津市化学试剂一厂; 超纯水( Mill-i Q. 18. 3 MV cm) ; 其他为实验室常用试剂. 1. 2 仪器与设备 Agilent 1100 高效液相色谱仪及数据处理平台, 美国Agilent 公司产品,包括自动进样器、光电二极管阵列检测器( DAD) 、柱温箱、进样瓶、涡漩振荡器、针管过滤器、0. 45 Lm 尼龙滤膜; HPLC 色谱柱: TSKgelG2000SWx l( 7. 8 mm @ 300 mm) .;1. 3 方 法 1. 3. 1 样品预处理 1. 3. 1. 1 标准样品的处理 用去离子水溶解一定量的混合标样B-Lg 和A-La, 质量浓度分别为2 g/ L 和1 g/ L. 取配好的混合标样溶液400LL 加入到1 600LL 处理液( 6mol/ L 盐酸胍溶液, 内含0. 1 mmol/ L EDTANa2, pH= 6. 0) 中, 再加入20 LL 2-巯基乙醇, 涡漩振荡器上振荡10 s, 充分混匀至没有明显泡沫出现. 室温孵育90 min. 上机前用0. 45 Lm尼龙滤膜过滤. 1. 3. 1. 2 固体样品和液体样品的处理 准确称量5. 0 g 奶粉, 用去离子水定容至100mL, 溶解充分后取400LL 溶液加入到1 600 LL 处理液中,再加入20 LL 的2-巯基乙醇, 接下来的处理过程同标样的处理过程一致.直接取400LL 液体样品加入到1 600 LL 处理液中, 再加入20 LL 的2-巯基乙醇, 接下来的处理过程同标样的处理过程一致 ;1. 3. 2 HPLC 色谱条件 HPLC 色谱柱: TSKgel G2000SWx l( 7. 8mm @ 300 mm) . 洗脱液为0. 1 mol/ L 磷酸盐缓冲液( NaH2PO4 + K2HPO4) + 0. 1 mol/ L NaCl+ 0. 005 g / L NaN3( pH=7. 0) , 流速为0. 5 mL/ min, 进样量为20LL, 检测波长为280 nm, 温度为25 e , 洗脱时间为20 min. 1. 3. 3 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS) 检测以奶粉和原料奶作为被检测样品, 上样量( 按蛋白质量计) 均为20 Lg 左右, 乳清饮料样品中蛋白质上样量约为7Lg 左右. 4 %的分离胶, 12 %的浓缩胶. 电泳条件: 恒压60 V, 时间60min, 然后恒压120 V, 时间90min. 以光密度计对带色的各谱带进行测定, 求得其颜色深度( OD) 的积分值, 样品谱带OD 值和标样谱带OD值作对比计算出样品中蛋白质的含量.;2 结果与分析 2. 1 HPLC 条件的选择优化及与SDS- PAGE 分离乳制品蛋白方法的比较 A- La 及B- Lg 的定量检测通常是根据聚丙烯酰胺凝胶电泳( PAGE) 技术来完成, 作为国家标准( GB/ T5413. 2- 1997) , 一直以来被广泛应用于蛋白质的分离鉴定, 如图1 所示. 但其具有以下缺点: 用时较长; 上样量较大, 且不同批次的染色剂和脱色剂很难保证每次都有相同的染色结果, 因此重现性不好, 定量检测差异性较大. 尽管RP-HPLC 以及超滤技术[ 7- 9] 也常常被用于二者的分离, 但前者检测过程中要使用2 个相, 后者还要进行一些复杂处理过程, 所以操作都较繁琐. 因此, 鉴于当前食品安全