虾夷马粪海胆致病菌强壮弧菌的pcr检测方法.pdf

第27卷第4期 大 连 海 洋 大 学 学 报 Vol.27 No.4 20 12 年 8 月 JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY Aug. 2012 文章编号:2095-1388(2012)04-0289-05 虾夷马粪海胆致病菌强壮弧菌的PCR检测方法 常亚青, 封妮莎, 王轶南, 丁君, 刘志敏, 穆小虎 (大连海洋大学 农业部北方海水增养殖重点实验室, 辽宁 大连 116023) 摘要:强壮弧菌Vibriofortis是虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius 的一种致病菌。 为建立强壮弧菌的 PCR检测方法, 根据强壮弧菌gyrB基因的高度变异区序列设计引物, 筛选出特异性强的3对引物VF-6、 VF-7及VF-8, 分别对强壮弧菌S0907及20株参比菌株进行PCR扩增, 结果显示,3对引物均对强壮弧菌 扩增出与预期大小一致的目的基因片段且参考菌株无扩增条带。 以不同稀释度的菌悬液制备的DNA模板 4 进行PCR扩增, 结果显示,3对引物VF-6、 VF-7及VF-8可检测的最低细菌浓度分别为4郾1伊10 、 4郾1伊 3 2 10 、 4郾1伊10 cfu/ mL; 对不同稀释度的细菌DNA模板进行PCR扩增, 结果显示,3对引物VF-6、 VF-7及 VF-8可检测的最低DNA含量分别为1郾4、 0郾14、 0郾014 pg/ 滋L。 试验结果表明:3对引物的特异性均较好, 但灵敏度存在差异, 其中以VF-8为引物的PCR检测方法最佳; 使用以VF-8为引物的PCR检测方法对实 验室养殖海胆及其生境样品进行初步检测, 健康海胆、 养殖海水及投喂的海带均为阴性, 而自然海域海水 中带有一定量的强壮弧菌。 关键词:虾夷马粪海胆; 强壮弧菌; PCR检测;gyrB基因 中图分类号: S947郾9摇 摇 摇 摇 文献标志码: A 摇 摇 虾夷马粪海胆 Strongylocentrotus intermedius 于 区序列设计引物, 筛选出特异性强、 灵敏度高的强 1989年由大连海洋大学自日本引进中国, 目前已 壮弧菌Vibriofortis PCR 检测方法引物, 旨在为海 经成为中国主要的海水养殖品种之一。 随着海胆养 胆的致病菌检测、 监控等提供参考。 殖业的发展及养殖环境的污染, 海胆也面临着病害 1摇 材料与方法 的威胁, 如海胆的黑嘴病、 红斑病、 秃海胆病等细 [1-4] 菌性疾病及海胆变形虫病等 。 海胆细菌性疾病 1郾1摇 材料 [5-6] 的主要病原菌多为弧菌 , 经本课题组研究证 强壮弧菌S0907 由大连海洋大学农业部北方海 实, 强壮弧菌Vibriofortis是虾夷马粪海胆的一种致 水增养殖重点实验室 (简称为本实验室) 提供, [7] 病菌 。 此外, 强壮弧菌还可导致虹鳟鱼患病, [7] 该菌分离自虾夷马粪海胆综合疾病患病处 。 参 [8] 也可使卤虫无节幼体死亡率达100% , 但目前尚 比菌