根瘤菌的分离与鉴定.ppt

L/O/G/O 根瘤菌的分离与鉴定 (1) 照相 (2) 挖掘和根瘤保存 根瘤选取：大个、新鲜、粉红色、尽量多取。 根瘤采集：1.主根上可以剥取少量根皮以保证根瘤完整。 2.侧根上的可带少许根。 采集 采集 农大豆2号 保豆3号 保存 每个单株植物的根瘤收集在一个卫生纸包中，每个采集点的多个植株放在一个装有硅胶的自封袋中。 分离及纯化 用无菌水浸泡干燥根瘤菌直至其复原。 2 .用95%的酒精浸泡3~5分钟，用5%的NaClO3 浸泡1分钟， 用无菌水清洗 5~7次（换水）。（在超净台上操作，并且在酒精灯附近，防止染菌） 分离及纯化 (1) 根瘤浸泡 (2) 根瘤消毒 分离及纯化 3.用牙签（灭菌时尖头朝上，平头朝下）的平头端在灭菌的玻璃平皿上将根瘤刺破（必要时可以滴加一滴无菌水）。用灭菌接种环蘸取菌液在YMA固体培养基上划线。用灭菌接种环蘸取同种菌液，在载玻片上进行革兰氏染色，镜检。 分离及纯化 消毒 刺破 划线 分离及纯化 4.待平板出现菌落后，观察，选取目的菌落再次划线纯化，镜检。 5.纯化后的菌划线在试管斜面培养基上，供保菌。 分离及纯化 挑菌，摇菌 稀释1万倍 稀释2万倍 稀释100万倍 保菌 使用YMA液体+20%甘油，吹打斜面上的菌，吸取保存。 使用YMA液体+20%甘油，吸取摇好的单个菌斑菌液。 提取基因组DNA 260/280:1.97 260/230:2.02 浓度：570ng/μl 鉴定 16S rDNA序列测定：方法同书。 其中：dNTP：2.5mm 引物：10μm 测序后，在NCBI blast 中进行比对， 一般情况下，相似性能达到99%左右。 L/O/G/O