沉淀分离技术.ppt

沉淀分离技术;沉淀的目的;生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些就是溶液的各种理化参数。 任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。;Add Your Title;沉淀能否发生;沉淀技术分离生化产物的典型例子是蛋白质的分离提取 优点：设备简单、成本低、原材料易得、 便于小批量生产； 缺点：所得沉淀物可能聚集有多种物质， 或含有大量的盐类，或包裹着溶剂， 产品纯度常比结晶法低， 过滤也较困难。;eg. 从血浆中通过5步沉淀生产纯度高达99%的免疫球蛋白和96%~99%的白蛋白。;沉淀法分离蛋白质的特点： 生产前期可使原料液体体积很快减小10~50倍，从而简化生产工艺、降低生产费用； 使中间产物保持在一个中性温和的环境； 可及早将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合液中分离出来，避免蛋白质的降解，提高产物稳定性； 用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色谱分离使用的限制因素降低到最少。;§3.2 蛋白质的溶解特性;蛋白质是两性高分子电解质，主要由疏水性各不相同的 20 种氨基酸组成。;;水化层; 蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。;;在低离子强度时，颗粒距离处在中间状态，双电层斥力占优势，可看为一个凝聚的势垒;DLVO理论;其他沉淀法;一、中性盐沉淀法（盐析法）;缺点;盐析; 蛋白质和酶均易溶于水，分子中的－COOH、－NH2和－OH等亲水基团，与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。 ;+;（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。;（2）破坏水化膜，暴露出憎水区域,由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。;（3）中和电荷，减少静电斥力，中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。;选用盐析用盐的几点考虑： ;阴离子： 柠檬酸根-3酒石酸根-3 F-I03-H2P04-S04-CH3C00-Cl-Cl03-Br-N03-Cl04-I-CNS- 阳离子： Th4+Al3+H+Ba2+Sr2+Ca2+Cs+ Rb+NH4+K+Na+Li+; 常用于蛋白质沉淀的盐为硫酸铵和硫酸钠。硫酸钠虽无腐蚀性但低于400C就不易溶解，因此只适用于热稳定性较好的蛋白质的沉淀过程。;（1）溶解度大 （2）分离效果好 （3）不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。 （4）价格便宜，废液不污染环境。;（1）加入固体盐法;查表法;不同量的硫酸铵溶解时会引起溶液体积的变化;计算法;（2）加入饱和溶液法 ;优点 硫酸铵浓度变化连续，盐析效果较好。 缺点 硫酸铵饱和度的测定、计算工作手续繁琐，而且透析袋容积有限、盐析速度慢、硫酸铵耗费大。 ;方法一：取料液分成等体积几份，冷却至0℃;蛋白质量(mg)或酶活力;方法二;蛋白质量(mg)或酶活力;6、盐析的影响因素 ;KS越大，有效成分溶解度随盐浓度增加而减小的程度越大。 KS越大，分级范围越小，盐析效果越好。;1——纤维蛋白 2——血红蛋白 3——拟球蛋白 4——血清蛋白 5——肌红蛋白; 例3.1 溶菌酶在2.8 mol/L和 3.0 mol/L 硫酸铵溶液中的溶解度分别为1.2g/L和0.26g/L，试计算在3.5 mol/L 硫酸铵溶液中的溶解度。; 例3.2 有100L蛋白质溶液，其中含牛血清蛋白BSA和另一种杂蛋白X，质量浓度分别为10g/L和5g/L。拟用硫酸铵沉淀法处理该溶液以回收沉淀中的BSA。20℃下BSA和X的Cohn方程参数列于下表（假设其他蛋白质的存在不影响方程参数），其中离子强度用硫酸铵浓度（mol/L）表示。;KS分段盐析法;（2） 蛋 白 质 浓 度;（3） pH 的 影 响;（4） 温 度 的 影 响;1）注意饱和度表中规定的温度； 2）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化； 3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心； 4）加入硫酸铵时应注意搅拌，避免局部过浓； 5）硫酸铵使用前须用H2S处理，高浓度的硫酸铵溶液使用前需用氨水或硫酸调节至所需pH。 ; 蛋白质等电点沉淀法是基于不