蛋白质与核酸研究.ppt

蛋白质的研究方法与技术 蛋白质含量的测定： 1。紫外光吸收法 2。Bradford法(考马斯亮蓝G-250法) 蛋白质分子大小的确定： 1。凝胶过滤法测定相对分子质量 2。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量 酶的研究方法与技术 酶活力的测定 一、基本定义 1。酶活力（enzyme activity） 指酶催化指定化学反应（酶促反应）的能力。酶活力的大小可以用在一定条件下（底物过量）所催化的化学反应的速率（初速率）来表示。　　 酶活力的测定 2。酶的活力单位 （U, activity unit） 1个酶活力国际单位（IU）是指在最适反应条件（指最适pH、25℃等）下，1分钟内能催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量。 酶活力的测定 酶活力的测定方法 酶的分离纯化 酶的分离纯化与普通蛋白质相比，要求更加严格。 核酸含量的测定 紫外分光光度法 核酸的凝胶电泳 DNA聚合酶链反应（PCR） PCR：体外扩增DNA的技术 核酸测序 核酸的分子杂交技术 Southern Blotting：检测DNA Northern Blotting：检测RNA * * 对蛋白质分子进行的各种研究，要建立在对蛋白质分子本身的性质（特别是区别于其它生物与化学分子的独特的性质）和各种实验手段的原理和适用性深入了解的基础上。 因材施法 蛋白质的研究 沉淀技术 层析技术 离心技术 电泳技术 过滤技术 蛋白质的研究 1。沉淀技术：中性盐沉淀反应 (盐析) 2。离心技术：分离沉淀和上清 3。过滤技术：超滤和透析 4。层析技术：凝胶过滤，离子交换层析和亲和层析的原理和应用 5。电泳技术：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和应用 蛋白质的研究 沉淀 离心 上清 盐析：高浓度的盐破坏蛋白质分子表面的水化层 蛋白质的研究 蛋白质 大分子 半透膜 小分子 小分子 透析与超滤法的原理 蛋白质的研究 凝胶过滤的原理与应用 log (Mr) Fractionation range 0 0.1 0.7 1 Kav (Ve)＝－b lg MW＋c 蛋白质的研究 + + — — — — — + + — — — — —— — — — — + + + + + + + + 平衡 加样与淋洗 洗脱 离子交换层析的原理 蛋白质的研究 亲和层析的原理 蛋白质的研究 SDS的原理与应用 logMW = k-bX 蛋白质的研究 免疫印迹（Western Blotting）技术 蛋白质的免疫检测技术 蛋白质的研究 蛋白质的研究 蛋白质的分离纯化 蛋白质的性质、结构与功能研究 蛋白质的研究 模块一、原料的选择处理和蛋白质的提取 蛋白质的分离纯化流程 模块二、蛋白质的粗纯化 模块三、蛋白质的精细纯化 模块四、成品的脱盐、浓缩、干燥和保存 蛋白质样品 分析与鉴定 蛋白质的研究 蛋白质的研究 蛋白质纯度的测定 电泳 测定酶的比活力 蛋白质的研究 蛋白质结构和功能的研究 综合使用各种方法 蛋白质的研究 3。酶的比活力（specific activity ） 指每毫克酶蛋白所含有的酶活力单位数。 比活力=活力U/mg蛋白=总活力U/总蛋白mg 灵敏度相对较低 (nmol/l) 操作简便，节省时间和样品，可用于动力学监测 底物、产物或指示剂在紫外或可见光部分吸光度不同 分光光度法 方法 缺点 优点 原理 衡量指标： a. 总活力（收率） b. 比活力（纯度） 核酸的研究方法与技术 核酸的研究方法 核酸的分离纯化和定量测定 核酸的离心分析 核酸的凝胶电泳 PCR 核酸的测序 DNA的化学合成 核酸的分子杂交 核酸的研究 核酸的分离纯化 要点： 利用各种核酸的特性选择合适的纯化方法（注意掌握原理）； 抑制核酸酶的作用，防止核酸的降解和变性。 核酸的研究 核酸的研究 A260=1 50 ?g/ml 双螺旋DNA 20 ?g/ml 寡核苷酸 40 ?g/ml 单链DNA/RNA 琼脂糖凝胶电泳分离核酸 并测定DNA分子量 核酸的研究 核酸的研究 必备条件 核心反应（原理） 核心酶与核心技术 应用 核酸的研究 双脱氧终止法测定DNA序列 核酸的研究 *