SouthernBlot实验流程包括原理细节.docx

Southern Blot 实验流程（包括原理/细节）一、DNA 的提取人和哺乳动物细胞基因组DNA的分离通常是在有EDTA、Sarkosye等一类去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚、氯仿抽提，经RNase 处理和纯化来提取DNA。(1)取单层细胞，经无钙、镁PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞悬液经PBS洗2次,弃上清，取细胞沉淀。(2)加入2ml细胞裂解液(10mM Tris HCL，pH8.0，0.1mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1%SDS)充分混匀，加入蛋白酶K 至终浓度为0.5～1g/L、Sarkosye终浓度为0.5%，混匀裂解蛋白呈糊状。(3)50℃水浴2h，转入37℃水浴过夜，次日加入等体积饱和酚，轻轻颠倒混匀，以防止DNA断裂，约3min。 12000r/min 离心15分钟（室温） (4)取水相，再加入等体积酚/氯仿(1:1),同样颠倒混匀，去除蛋白质12000 r/min 离心15分钟（室温）(5)再重复步骤(4)，再用等体积酚/氯仿(1:1)抽提一次(6)取水相，再加入等体积氯仿，去除酚及蛋白质，颠倒混匀12000 r/min 离心15分钟（室温）(7)取水相，加入2倍体积的预冷无水乙醇，沉淀DNA，混匀-20℃放置1小时12000 r/min 离心15分钟（室温）(8)用70%乙醇洗涤一次，按上法离心将沉淀真空干燥10分钟。(9)加入RNase A至终浓度100mg/L，37℃水浴消化1小时，消化污染的RNA。(10)加入蛋白酶K 至终浓度0.4g/L、Sarkosye至终浓度0.5%，混匀，50℃水浴2小时，加入NaAC至终浓度10mmol/L。(11)用等体积饱和酚各抽提一次，步骤同前。(12)吸上清，加入氯仿/异戊醇(24:1)，按上法再抽一次。(13)取水相，加入2倍体积预冷无水乙醇，-20℃ 1小时。(14)取沉淀用70%乙醇洗一次，真空干燥10分钟后溶于少量TE中，4℃贮存。Southern对DNA的质量要求比较高，一般来说，高质量DNA 样品需具备以下几点：① DNA 完整性好；② DNA 纯度高；③ 勿用TE 溶解DNA；④ DNA 浓度不低于0.7ug/ul，杂交需模板DNA 约20ug/泳道/次二、引物设计三、DNA 检测1、DNA浓度的测定DNA浓度用紫外分光光度计测定，核酸的光吸收值位于波长260nm处，蛋白质则位于280nm，分别测定后，其OD260/OD280的比值应大于 1.8.低于此值，说明DNA中仍残留较多的蛋白质，此时可用酚、氯仿继续抽提纯化。若比值大于1.9表明DNA链破坏，断裂严重，已成为小分子，因此操作应轻柔。取少许DNA溶液，经紫外线扫描，吸收峰值位于波长260nm处，其纯度应为OD260/OD280=1.8,OD260值为1的溶液大约含50μg/mL DNA，故DNA的浓度 (μg/mL)=OD260值×50μg/mL×稀释倍数。DNA总量(μg)=DNA浓度(μg/mL)×总体积 (mL)2、DNA分子量的测定DNA分子量大小测定，可用含溴化乙锭的1%琼脂凝胶电泳法测定，根据加入标准品片断的电泳迁移距离计算样品片断分子量大小，此技术还可用作分离基因组 DNA，进一步进行Southern吸印分析。四、探针制备（以PCR 标记方法为例）1、标记原理Dig-dUTP 在Taq DNA 聚合酶的作用下，经基因特异的引物PCR 指数扩增，可掺入到新合成的DNA 分子中，从而完成DNA 探针的标记。在延伸反应中，每20~25 个核苷可有一个Dig-dUTP 分子掺入到新合成的DNA 链中。2、操作步骤1）探针标记注意：在探针标记前，必须用普通PCR 优化反应条件（试剂盒中提供了过量的Taq DNA 聚合酶及其Buffer，建议用于条件优化），包括引物、退火温度、延伸时间、模板量等，设定好最佳反应条件。任何非特异扩增可能导致高的杂交背景甚至假阳性。在标记反应的同时，用普通dNTP 做一个相同体系的非标记PCR 扩增。扩增体系： 组份D标加量Control加量10×buffer (plus Mg2+) 2μl 2μl1μl000.4μl引物F/R1μl 1μl模板 1μl 1μl1μl1μl14μl14.6μlPCR扩增：95℃ 5min;[ 95℃ 30sec,60℃ 35sec, 72℃ 30sec;] 72℃ 5min; 30 cycles2）标记探针检测取标记产物和普通PCR扩增产物各1μl，1.0%的琼脂糖凝胶电泳。由于大分子量的DIG掺入，标记产物泳动速度比普通PCR产物要慢。所以根据电泳图就可以判断是否标记上和有没有非特异标记！其余标记产物-20℃保存。 如果要准确检测标记效率（一般不必），取标记产物1μl和Dig标记的