带His-tag的解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2在毕赤酵母中的-矿业科学学报.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，３１（４）：５３５９ 带Ｈｉｓｔａｇ的解脂耶氏酵母脂肪酶Ｌｉｐ２ 在毕赤酵母中的表达及纯化 汪小锋　申旭光　赵鹤云　孙永川　纪昌涛　闫云君 （教育部分子生物物理重点实验室 华中科技大学生命科学与技术学院　武汉　４３００７４） 摘要　将去自身信号肽并且Ｎ端带６×Ｈｉｓ标签的ＹｌＬｉｐ２基因克隆至表达载体ｐＰＩＣ９Ｋ中，电转 化ＧＳ１１５获得高效表达脂肪酶ＨｉｓＹｌＬｉｐ２的基因工程菌。筛选到的阳性克隆子摇瓶发酵脂肪酶 ６ 活力最高为４００Ｕ／ｍｌ。对重组毕赤酵母在１０Ｌ发酵罐中表达ＨｉｓＹｌＬｉｐ２的分批补料发酵工艺进 ６ 行了初步优化，探讨了培养基、ｐＨ、温度对生物量和重组蛋白表达量的影响。结果表明：采用 ＦＭ２２培养基，诱导温度为２５℃，ｐＨ５．０，甲醇诱导 １１４ｈ后 ＨｉｓＹｌＬｉｐ２的最高酶活力达到 ６ ３１６０Ｕ／ｍｌ。ＳＤＳＰＡＧＥ分析表明，蛋白的分子量大约为３８ｋＤａ。重组的ＨｉｓＹｌＬｉｐ２经镍柱一步纯 ６ 化后的纯度达到９５．４３％，比酶活达到４２５０Ｕ／ｍｇ。 关键词　毕赤酵母　解脂耶氏酵母　组氨酸标签　高密度发酵　脂肪酶 中图分类号　Ｑ８１４．１ 　　脂肪酶（ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌａｃｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ，ＥＣ３．１．１．３） 本较低等优点。 是一类重要的酯键水解酶，在食品、洗涤、制革、饲料、 　　本文采用毕赤酵母表达系统，将去自身信号肽并 油脂加工、有机合成、生物能源、对映体拆分和工具酶 且Ｎ端带６×Ｈｉｓ标签的ＹｌＬｉｐ２基因克隆至甲醇诱导 ［１］ 等领域应用十分广泛 。解脂耶氏酵母胞外脂肪酶 型表达载体ｐＰＩＣ９Ｋ中，电转化到ＧＳ１１５中获得高效表 Ｌｉｐ２（ＹｌＬｉｐ２）在水解、酯化和转酯反应中都表现出较高 达ＨｉｓＹｌＬｉｐ２的基因工程菌，并对重组蛋白在１０Ｌ发 ６ ［２］ 的活力 ，在酯合成、生物柴油的生产和对映体拆分等 酵罐中的高密度工艺进行了研究，以期为该脂肪酶的 ［３４］ 领域具有广阔的应用前景 。 大规模工业化生产和应用奠定技术基础。 ［５］ 　　野生型的Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ菌株能产生多种脂肪酶 ， 分泌到胞外的脂肪酶主要是 ＹｌＬｉｐ２，但产酶量较低。 １　材料和方法 ［６］ Ｄｅｓｔａｉｎ等 为了提高ＹｌＬｉｐ２的表达量，采用诱变的方 １．１　材　料 法筛选到一株高产胞外脂肪酶 ＹｌＬｉｐ２的突变株 １．１．１　菌株和质粒　Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳ１１５（ｈｉｓ４）菌株、 ＬｇＸ６４．８１。以ＬｇＸ６４．８１突变株为出发菌株，法国的研 ｐＰＩＣ９Ｋ质粒、Ｅ．ｃｏｌｉＴｏｐ１０菌株均购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公 究小组对其进行了大量的工程化改造，构建了一系列 司。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ菌株为中国科学院微生物所赠送。 解脂耶氏酵母胞外脂肪酶 Ｌｉｐ２的多拷贝同源表达菌