引子合成原理B1.PDF

引子合成原理引子合成原理 (B1) 引子合成原理引子合成原理 Oligo primer 的人工化學合成始於 50 年代初期，1980 年全自動化的固相引子合 成儀問市後，使得快速、高效率合成 Oligo primer 成為可能，大大地推動了生 物工程技術的蓬勃發展。現在一般都採用 β- 乙腈亞磷醯胺化學合成 Oligo primer ，合成是從 3→5 方向進行，通常 3 端的第一個鹼基已結合在 Glass 載 體（ Controlled Pore Glass ，CPG ）上。合成的詳細過程如圖，現簡要說明如下： Step1(Detritylation) ：脫去附加在 CPG 載體上的第一個鹼基 5-OH 基團 上的保護基（DMTr) ，預備加入下一個新的鹼基。 Step2 ：活化新的鹼基單體 (Phosphoramidite) ，準備與第一個鹼基進行反 應。 Step3(Coupling) ：第二個鹼基與第一個鹼基發生偶合反應。 Step4(Capping) ：將沒有反應的第一個鹼基的 5-OH 加帽封死 (Capping) ，使其不再進一步參與反應。 Step5(Oxidation) ：將核苷亞磷酸酯氧化成更穩定的核苷磷酸酯 即將三價( 磷氧化成五價磷 ) 。 重複進行 Step1 ～Step5 的步驟，直到合成完所需的 Oligo DNA 序列。 合成結束後，將 Oligo DNA 分子從 CPG 上切下，再進行下一步的純化。 引子的純化 引子的純化 引子的純化引子的純化 從 DNA 的化學合成原理可知， DNA 的化學合成是從 3 端開始，經一系列的 化學反應，逐一地將鹼基連接起來。其中，偶合反應的效率可達到 99% ，也就 是說，每加上一個新鹼基，都會有總量 1% 的 DNA 片段附加不上新的鹼基 ( 出 現合成失敗 DNA 片段) ，而這些合成失敗的 DNA 片段全部殘留在合成 DNA 粗製品中。如果使用此粗製品直接進行 PCR 反應、定序反應時，便會影響實驗 結果。 一般，粗製品中的目標 DNA 序列和失敗 DNA 序列的比例大致如下表 合成長度合成長度 全長引子比例全長引子比例(%) 失敗引子比例失敗引子比例(%) 合成長度合成長度 全長引子比例全長引子比例 失敗引子比例失敗引子比例 20mers 83 17 50mers 61 39 75mers 48 52 100mers 37 63 這些值是假設每次偶合反應的效率為 99% 時計算出的近似值，如果進一步考慮 其他因素，上表中的失敗 DNA 的比例還會進一步增大。因此，對合成 DNA 粗 製品進行純化是非常重要的步驟。下面說明我們的 DNA 合成製品的等級分類。 合成引子純化等級分類：合成引子純化等級分類 ： 合成引子純化等級分類合成引子純化等級分類 ：： de-salted oligo ( 只有 30% : 60-mer 到 68%: 20-mer ) De-salted 只有 30% : 60-mer 到 68%: 20-mer OPC 純化製品：純化製品 ： 純化製品純化製品 ：： 採用 OPC(Oligonucleotide Purific