试验四细菌的接种培养法与生长现象的观察.DOC

细菌接种培养与生长现象的观察 【目的和要求】 1掌握无菌技术，建立无菌观念；明确无菌操作时注意要点。 2掌握细菌的接种、分离培养方法和接种环的制作方法。 3熟悉细菌生长现象的观察方法。【试剂与器材】 1菌种：葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌等。 2培养基：固体、半固体、液体培养基。 3其他：酒精灯、接种环、接种针、L形玻棒、打火机、记号笔等。【实验内容】 细菌的接种工具 接种环和接种针：其结构包括环（针）、金属柄、绝缘柄三部分（见图4-1）。其中环（针）部分最佳材料为白金丝，因其受热和散热速度快，硬度适宜，不易生锈且经久耐用，但因为价格昂贵而限制了其应用。目前实验室常用的是经济实用的300~500W电热镍鉻丝。一般要求接种环长5~8cm，直径为2~4mm，定量接种环的容量为0.001ml。 图4-1 接种环和接种针 接种环（针）在使用之前需检查镍鉻丝是否呈直线，若有弯曲，需用吸管或接种环的另一端将其压直；若环不圆，可将镍鉻丝前端放在吸管尖部缠绕一圈，再将镍鉻丝突出的部分朝内压紧。 接种环用于固体、液体培养基的接种，接种针用于半固体培养基的接种。 L形玻棒：由直径2~3mm的玻璃棒弯曲成L形制成。在使用之前用厚纸包扎后置高压蒸汽灭菌，或沾取无水乙醇后在火焰上烧灼灭菌。主要用于液体标本涂布接种。细菌的接种方法 液体培养基的接种 该法主要用于细菌的增菌培养或进行细菌的生化反应。 方法：（图4-2） 1）先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许。 2）左手拿试管，右手持接种环，用右手其余手指将试管塞打开，试管口通过火焰烧灼灭菌。 3）将接种环在贴近液面的管壁上上下碾磨数次，使细菌均匀分布于培养基中。 4）将管口灭菌后加塞，接种环烧灼灭菌后放回原处。 5）在试管上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。 图4-2 液体培养基接种法 半固体培养基的接种 该法可用于保存菌种、观察细菌的动力或进行细菌的生化反应。 方法：（图4-3） 1）先将接种针在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许菌落。 2）左手拿试管，右手持接种针，将试管塞打开后，试管口通过火焰灭菌，将接种针从培养基的中心向下垂直穿刺接种至试管底上方约5mm处（勿穿至管底），然后由原穿刺线退出， 3）将管口灭菌后加塞，接种针烧灼灭菌后放回原处。 4）在试管上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。 图4- 半固体培养基接种法 平板划线接种法 该法可将标本中的多种细菌分散成单个菌落，有利于细菌的分纯和进一步鉴定。 方法：1）连续划线法（图4-4）先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许。 左手平板，用手掌托着平板底部，五指固定平板边缘，在酒精灯旁以拇指、食指和中指将平板盖撑开大约30~45°角，将已挑取细菌的接种环先在平板均匀涂布，然后划线完毕，将平板扣入平板盖，接种环烧灼灭菌后放回原处。 在平板底上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。 图4-4 固体培养基连续划线法 2）分区划线法（图4-5） 先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许菌落。 同上法将平板盖打开约30~45°角，将已挑取细菌的接种环在平板一端（1区）内作来回划线，再在2、3、4区依次划线，每区的划线须有数条线与上区交叉接触，每划完一区是否需要烧灼接种环依标本中的菌量多少而定，每区线间需保持一定距离，线条要密而不重复。 划线完毕，将平板扣入平板盖，接种环烧灼灭菌后放回原处。 在平板底上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。 图4-5 固体培养基分区划线法 斜面培养基接种法 斜面培养基主要用于细菌的纯培养，以进一步鉴定细菌或保存菌种。 1）将接种在火焰上烧灼灭菌，待冷却后以无菌操作挑取少许菌落。 2）左手拿试管，将取有细菌的接种再由下至上在斜面上作曲线划线。3）管口灭菌后加塞，接种烧灼灭菌后放回原处。 4）在试管上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。 图4-6 斜面培养基接种法 5．涂布接种法 本法主要用于活菌计数和药敏试验。 1）活菌计数：取一定稀释度的菌液0.1ml滴在平板上，用无菌L型玻璃棒将液滴涂布均匀，盖上平板盖，经35℃培养18~24h后计数菌落，则每毫升所含活菌数=菌落数×10×稀释倍数。 2）直接涂布法：多用于纸片法和管碟法药敏试验。先配制一定浓度的菌液，用无菌棉签蘸取菌液后，在管壁上将多余的液体挤去，在MH琼脂平板上按三个方向均匀涂布3次，最后沿平板边缘涂一周。盖上平板盖，置室温放置5min使平板表面稍干，然后用无菌镊子将药敏纸片贴在培养基表面，或向竖在平板表面的牛津小杯内加入不同浓度的药物，经35℃培养18~24h后观察结果，测定抑菌圈直径，按判断标准判定结果。倾注培养法 取菌种前灼烧接种针环要镍鉻丝烧红烧红的接种针（环）