片段克隆以及阳性克隆的筛选菌落PCR.PPT

免疫化学检测法 对所有的转化细胞进行培养，把一张硝酸纤维膜均匀地压在含有许多单个菌落的培养皿表面，用碱处理膜，使细胞裂解，表达产物蛋白质将释放出来，加入带放射性的某一特定基因编码的蛋白质的抗体可与表达产物蛋白质结合，自显影即可检出。 思考题 用蓝白斑筛选，以获得阳性克隆。那它和直接利用AMP抗性，而不用蓝白斑筛选，有什么区别吗？蓝白斑筛选有什么作用吗？  目的基因（β珠蛋白基因）片段克隆以及阳性克隆的筛选 ——菌落PCR 邱逸敏 基因工程与发酵工程教研室 DNA克隆的过程 获得目的DNA片断 (提取质粒DNA、PCR、酶切） 载体DNA与目的基因连接 转化受体细胞 筛选转化子 表达目的基因 连接反应后，可形成多种类型的DNA分子1.不带外源DNA的载体自连分子2.外源DNA彼此相连的多聚DNA分子3.载体与外源DNA相连的分子 通过筛选鉴定： 1.有没有外源DNA 2.外源DNA的连接方式是否正确 重组子筛选方法 遗传检测法 物理检测法 菌落原位杂交法 免疫化学检测法 测序 菌落PCR 遗传检测法 （1）抗药性记号插入失活选择法 （2） β-半乳糖苷酶显色法筛选重组子----α-互补作用 利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒pUC118质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，该位点如果没有插入外源目的基因，lacZ基因便可表达出?半乳糖苷酶，如果平板培养基中含有IPTG（乳糖操纵子的诱导物）和X-gal，X-gal（ ?半乳糖苷酶的底物）便会被?半乳糖苷酶水解成兰色，大肠杆菌形成蓝色克隆 在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆 菌落原位杂交 提取质粒酶切法需要提取质粒,当筛选的样品较多时,操作比较繁琐； 蓝白斑筛选法需要载体有特殊的结构; 杂交筛选法除操作比较复杂外,尚需使用同位素;插入失活法仅适用于个别载体。 本次实验中抗性平板上生长菌落数量众多，采用一种快速、简便的筛选方法——菌落PCR 菌落PCR ：是直接以转化菌的单个克隆为模板,通过特异性引物或通用引物对插入载体中的目的基因快速扩增，用于鉴定和筛选阳性转化菌的技术。 与传统的鉴定方法相比,由于其具有快速、经济、简便的特点而被广泛用于转化菌、特别是大量转化子的鉴定和筛选 。 操作步骤 在PCR管中加入PCR pre-Mix（已配好） 为平板上将要挑取的菌落标上号码（每组挑取8个菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至PCR管中（牙签在pre-mix中洗一下） 用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至试管中（牙签在LB液体中洗一下），220rpm/mim过夜。 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 菌落PCR体系：20 ul 预混 9份 2×PCR pre-mix：10 ul 90ul (with Mg++,dNTP,rTaq) Primer 1 10 mM：0.25 ul 2.25ul Primer 2 10 mM：0.25 ul 2.25ul ddH2O ： 9.5 ul 85.5ul 预混在1.5ml的EP管中，充分混匀，离心，分到8个PCR管中，20ul/管，冰浴放置 菌落PCR和常规PCR的比较 菌落PCR： 常规PCR： 95℃ 6 min 94℃ 3min 94℃ 40s 94℃ 40s 58℃ 32s 58℃ 32s 72℃ 90s 72℃ 90s 35 cycle 35～40 cycle 72℃ 10min 72℃ 10min 前变性94