利用四唑盐染料WST反映巨噬细胞受脂多糖刺激-中国医药生物技术.PDF

242 中国医药生物技术 2015 年 6 月第 10 卷第 3 期 Chin Med Biotechnol, June 2015, Vol. 10, No. 3 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.03.009 ·论著· 利用四唑盐染料 WST 反映巨噬细胞 受脂多糖刺激活化后的氧化应激 和代谢变化 鞠瑞，陈玮，陈晨，郭磊，李娟，叶菜英，张德昌 【摘要】 唑盐（WST ）得到广泛应用。与 MTT 相比，WST 目的 通过四唑盐染料显色方法分析巨噬细胞受脂多糖刺 （WST-1 或 WST-8 ）主要有两个特点，一是不可 激后的氧化应激和代谢变化，分析这种方法在炎症研究中的 通过细胞膜，二是被还原生成的甲瓒为水溶性物 应用价值。 质。其中 WST-1 是 WST 系列的第一个四唑盐试 方法 通过活细胞计数方法和 CCK-8 检测试剂分别检测 剂，WST-8 相比 WST-1 更加稳定，灵敏度更高， RAW264.7 巨噬细胞的活力；用 CCK-8 和 WST-1 显色方 溶解性更强。由于 WST 不可通过细胞膜，如果在 法研究超氧阴离子的释放；用 DCFH-DA 荧光染色和流式 没有中间电子载体 1- 甲氧基-5- 甲基酚嗪硫酸甲酯 细胞术检测细胞内活性氧的生成；用乳酸检测试剂盒和烟酰 盐（1-mPMS）的情况下显色，则是因为被释放至 胺腺嘌呤二核苷酸 NAD+(H) 检测试剂盒分别检测上清中 细胞外的超氧阴离子还原，可反映细胞超氧阴离子 乳酸和细胞内 NADH 的含量。 的释放和呼吸爆发情况；如果在 1-mPMS 存在的 结果 经脂多糖刺激的 RAW264.7 细胞的活细胞计数结果 情况下显色，不仅反映超氧阴离子的生成，还可能 和 CCK-8 显色结果存在反差；相同数目的正常培养细胞和 是通过 1-mPMS 接受了细胞膜上的跨膜电子，可 脂多糖刺激细胞的 CCK-8 显色比较，后者读数显著升高， 以反映细胞内 NADH 生成的情况[1-2] 。NADH 的 超氧化物歧化酶能够下调 CCK-8 显色读数，WST-1 显色 含量变化以及 NAD+/NADH 比值的变化是细胞代 结果与 CCK-8 一致，脂多糖刺激细胞中的活性氧含量显著 谢变化的重要指标，可反映线粒体三羧酸循环和电 增加；脂多糖导致 RAW264.7 细胞上清中的乳酸含量和细 子传递链活性的改变[3] 。 胞内的 NADH 含量显著增加。 脂多糖（LPS ）可以刺激巨噬细胞的经典活化， 引发强烈的炎症反应，释放大量的炎症细胞因子。 结论 应用 WST 染料测定经脂多糖刺激的 RAW264.7 Check 等[4]采用高铁细胞色素 c 还原的方法进行 细胞活力时，测定结果会受到细胞中还原性物质——超氧阴 检测表明，RAW264.7 巨噬细胞经 LPS 刺激后， 离子和 NADH 含量变化的干扰。通过 WST-1 或 WST-8 细胞膜上的 NADPH 氧化酶活性显著升高，释放 显色实验，可验证脂多糖能够刺激 RAW264.7 巨噬细胞发 的超氧阴离子增多。 生氧化应激和能量代谢变化。这一显色实验在炎症研究和药 在 LPS 刺激巨噬细胞炎症反应的过程中，细 物