原代细胞培养-蚌埠医学院科研处.DOC

细胞培养试剂的配制 一、Hank’s液配方： KH2PO4 0.06g， NaCl 8.0g， NaHCO3 0.35g， KCl 0.4g， 葡萄糖1.0g， Na2HPO4·H2O 0.06g， 加H2O至 1000ml 注：Hank’s液可以高压灭菌。4℃下保存。 二、磷酸盐缓冲液(PBS)的配制 母液的配制： 0.2M Na2HPO4：称取71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于1000ml 水 0.2M NaH2PO4：称取31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml水 各种浓度PB(pH=7.4)的配制： 先配 0.2M PB (pH=7.4，100ml)：取19ml 0.2mol/L 的 NaH2PO4， 81ml 0.2mol/L 的 Na2HPO4, 即可。 然后只需将0.2M PB (pH=7.4)按相应比例适当稀释即可，如： 0.1M PB（PH=7.4）：取500ml 0.2M PB，加水稀释至1000ml 即可。 0.01M PB（PH=7.4）：取50ml 0.2M PB，加水稀释至1000ml 即可。 0.02M PB（PH=7.4）：取100ml 0.2 M PB，加水稀释至1000ml 即可。 若需要NaCl的话，加入NaCl至0.9%（g/100ml）即可。 三、胰蛋白酶溶液的配制 配制胰蛋白酶时，要注意药品的牌号，活性及保存时间。不同的牌号、质量会有差别，更重要的应注意酶的活性。配制时，应按所标活性(一般活性为1：250)配制最适浓度的溶液。 配制方法下： 0．25％胰蛋白酶(活性1：250)溶液的配制： 1：250 胰蛋白酶 0.25g Hank 液 100ml 配制时，先用少量Hank 液溶解胰蛋白酶，然后再将余液加入。置于370C 水浴中，溶解lh(时间长短取决于溶解程度，待溶液全部透彻清亮为止)。溶解后，用除菌滤器过滤，无菌分装，密封，贴好标签，置于低温冰箱(-20℃)保存。使用前，用7.4％NaHCO3 调PH 至7.6-7.8。 四、0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA混合消化液 ??? 胰蛋白酶(Trypsin)粉???????????????? 0.25g ??? EDTA粉???????????????????????????? 20.0mg ??? 0.01mol／L PBS????????????????????? 100ml 先用少量PBS溶解胰蛋白酶，然后将EDTA粉末和剩下的液体加入混合，置37℃水浴中1小时左右(待彻底溶解，液体呈透明为止)，用滤器过滤，分装置-20℃冰箱中保存。 五、青(100单位／m1)-链霉素(0.1mg/ml)的配制 配制时，将上述两种药品溶解于生理盐水(或Hank 液)100ml 中。然后用除菌滤器过滤(或在无菌间内，用灭菌的盐水配制亦可)，分装于青霉素瓶中，放冰箱(或-20℃)保存，备用。 使用时，可按100单位/m1 稀释。 青霉素：80万单位／m1一瓶用培养液8ml稀释，备用。 链霉素：1g一瓶用培养液2ml稀释，备用。 保存：4℃或-20℃保存。 500ml培养液加入以上配好的0.5ml青霉素，0.1ml链霉素。 六、0.5％台盼蓝染液的配制 台盼蓝0.5g，溶于100mlPBS液中。待溶解后，过滤以去除不溶解的杂质。 检查细胞活力时，取20ul细胞悬液加20ul台朌蓝染液，3～5分钟后观察及用计数板计数，此时，活细胞透明无色，死细胞被染成均匀蓝色，但不得超过15min。 七、血清灭活 1、从冰箱中取出血清瓶，放入装有清水的盆中，放入4度冰箱中自然融化； 2、融化后尽快把血清瓶放入56℃水浴中，水面超过血清面约1～2cm； 3、每5分钟晃动血清瓶，摇匀血清。灭活30分钟后，取出血清，放入冷水浴中复温。冻存于-20℃或分装后冻存。 注：血清必需先经灭活补体后才能使用。血清在-20度可保存1～2年。1. 剪切组织 先将所取得的组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除粘附的结缔组织等非培养所需组织。再次清洗后，用手术剪将组织剪成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。2. 消化分离 消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。3. 培养细胞悬液用计数板进行细胞计数，用培养液将细胞数调整为2～5×105 cells／m1，或实验所需密度。分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。一般3～5d，原代培养细胞可以粘