《水产品中呋喃唑酮代谢物（AOZ）的快速测定 酶联免疫法》标准文本.docVIP

ICS67.120.30 B50 DB22 吉林省地方标准 DB 22/ XXXXX—XXXX 水产品中呋喃唑酮代谢物（AOZ）的快速测定 酶联免疫法 Rapid determination of fruzalidone metabolite residues in aquatic products-Enzyme linked immunosorbent assay method XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 吉 林 省 卫 生 厅发布  前言 本标准由吉林省卫生厅提出并归口。 本标准起草单位：长春市水产品质量安全检测中心。 本标准主要起草人：闫先春、杨炳坤、杨立军、王雅倩、修磊。水产品中呋喃唑酮代谢物（AOZ）3-amina-2-oxazolldinone,AOZ）的酶联免疫快速测定方法。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规则和试验方法 SC/T3016-2004 水产品抽样方法 原理 测定的基础是利用抗原抗体的特异性反应，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的AOZ 经衍生化后和酶标板微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗呋喃唑酮代谢物的衍生物抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物AOZ的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中呋喃唑酮代谢物的残留量,从而达到定量或者定性的目的。 试剂与材料 乙酸乙酯（分析纯） 正己烷（或正庚烷）（分析纯） 三水合磷酸氢二钾（分析纯） 浓盐酸（分析纯） 氢氧化钠（分析纯） 水应符合GB/T6682-2008规定的一级水标准 衍生化试剂（10 mmol/L）：向装有15.1 mg 2-硝基苯甲醛的试剂瓶中加10 mL甲醇溶解混匀。 磷酸氢二钾溶液（0.1mol/L）:称取 22.8 g 三水合磷酸氢二钾加1L去离子水溶解混匀。 1 mol/L盐酸溶液:量取8.3 mL浓盐酸加入去离子水定容至 100 mL。 1 mol/L 氢氧化钠溶液: 称取4.0 g氢氧化钠加100 mL去离子水溶解混匀。 复溶工作液:用去离子水将 2×浓缩复溶液按 1︰1 1份2×浓缩复溶液+1份去离子水）用于抗体浓缩液的稀释、酶标二抗浓缩液的稀释及提取样本的复溶。 洗涤工作液：用去离子水将 20×浓缩洗涤液按 1︰19 1份20×浓缩洗涤液+19 份去离子水）用于酶标板的洗涤。 试剂盒提供试剂包括：抗体预包被的96孔板，AOZ标准溶液、AOZ抗体、底物显色剂、酶标记物、反应终止液、浓缩复溶液、洗涤缓冲液。 仪器与设备 微孔板酶标仪 450 nm/630 nm 旋转蒸发仪/氮气吹干装置 均质器 振荡器 涡旋仪 离心机 天平：感量 0.01 g 刻度移液管：10 mL 洗耳球 玻璃试管：10 mL 聚苯乙烯离心管：2 mL、50 mL 微量移液器：单道 20 μL～200 μL、100 μL～1000 μL、多道 250 μL 测定方法 制备与保存 抽样：按SC/T3016-2004的方法进行。 样品经处理后，取可食部分（苗种取全身）100 g，用组织捣碎机捣碎，装入样品袋，标明标记，放入-18℃冰柜中冷冻保存。 提取纯化 6.2.1 称取 1.0±0.05 g 的均质物（鱼/虾）至50 mL 聚苯乙烯离心管中，加入4 mL 去离子水，0.5 mL 1 mol/L 盐酸溶液（见4.9）和100 μL衍生化试剂（见4.7），充分振荡 2 min；在60℃孵育3h； 6.2.2 分别加入 5mL 0.1mol/L 磷酸氢二钾溶液（见4.8）0.4 mL 1 mol/L 氢氧化钠（见4.10）和5 mL乙酸乙酯，剧烈振荡30 s；3000 r/min以上，温度20-25℃离心10 min； 6.2.3 取出2.5 mL上层有机相至10 mL 干净玻璃试管中，50～60℃1mL 正己烷溶解干燥物，用1 mL 复溶液工作液（见4.11）充分混合;高脂肪样本，可加大正己烷用量，用 3mL 正己烷溶解干燥物。在室温下（20-25℃）3000 r/min以上离心10 min；除去上层有机相，取50 μL下层水相用于分析。 测定 将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃30 min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2～8℃ 将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。 抗体工作液的稀释：将抗体浓缩液用复溶工作液按照