第六讲固定化酶技术.ppt

第六讲 固定化酶技术 酶催化具有效率高、专一性强、速度快等优点。 但是，酶是蛋白质，分离纯化过程复杂、稳定性差，不能反复使用，价格较昂贵。 目前，酶主要在医药、食品及高附加值化工产品上广泛应用，其它领域则相对较少。 为扩大酶的应用范围并降低成本，有效的途径是实现酶的多次使用或直接使用细胞；固定化酶技术就是在这种思路下发展起来的。 自上世纪60年代初就有人研究过固定化酶，最初是以色列人以木炭、骨髓等吸附酶， 然后是日本的千佃一郎领导的制药公司，首先将氨基酰化酶固定于葡聚糖凝胶中，用于拆分DL-氨基酸； 接着召开了两次固定化酶的国际酶工程年会。 一、制备固定化酶的基本策略 二、固定化酶的优缺点 三、酶的固定化方法 1. 载体结合法 该法将酶与水不溶性载体结合形成固定化酶 根据结合的形式不同，可分为： ⑴物理吸附法 ⑵离子结合法 ⑶共价结合法 ⑶共价结合法 共价结合法使用的载体主要有： 纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳素及其衍生物、氨基酸共聚物、甲基丙烯酸（或醇）共聚物、多孔玻璃等。 ①酰化反应 ②芳化和烷基化反应 ③溴化氰反应 对于纤维素载体等多糖 直接在糖环上固定酶可能导致固定和传质阻力大； 在碱性条件下可接枝一个柔性手臂进行改善； 与β-硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)反应，生成对氨基苯磺酰乙基纤维素（ABSE-纤维素），再重氮化偶联。 接枝氨基酸的交联壳聚糖微球与酶反应，接入亲水柔性手臂。 ④重氮化反应 ⑤硅烷化反应 (6)活性酯法 该方法对于具有游离羧基的载体适用 该方法对于巯基载体适用 2. 交联法 ⑵异氰酸 ⑶重氮联苯胺 ⑷碳化二亚胺 ⑸二环氧化物 用两末端都含有环氧基团的化合物,如1,4-丁二醇二缩水甘油醚，二环氧辛烷，与具有亲核性的基团，如羟基、伯氨基或巯基作用（与羟基作用在高pH、氨基在弱碱性） 二乙烯砜 二乙烯砜是一种高活性的化学试剂，一般在碱性水溶液中进行反应。反应温度为室温 3.包埋法 固定化酶的性质 活力变化 在多数情况下，比活力低于天然酶，少数提高。例如羧甲基纤维素固定的胰蛋白酶活力仅为原酶的30%（水解酪蛋白），这主要是固定化使酶活动空间、底物、产物扩散受限所致。 稳定性 大部分酶固定化后稳定性提高，少数下降 热稳定性，提高最适温度，一般是10℃以上 对有机溶剂的稳定性及酶抑制剂的稳定性提高。 pH稳定性，明显优于游离酶。一般而言，用带负电荷载体制备的固定化酶，其最适pH值比游离酶高；用带正电荷载体制备的固定化酶，其最适pH值比游离酶低；主要是吸附相反电荷离子的电荷平衡造成的。 固定化酶的反应动力学 酶固定化后，结构改变，位阻效应、分配效应及扩散效应均发生改变，对催化活性有显著影响。 位阻效应（屏蔽效应）：指由于载体内微孔孔穴过小，或者固定化造成的酶与底物结合障碍。 分配效应：指固定化酶与固定化载体间亲疏水性及静电作用差异所造成的底物或产物浓度与溶液主体浓度的差异。 扩散效应 底物、产物在固定化酶、载体及主体溶液间扩散速率存在的差异 以上是影响固定化酶反应动力学的主要因素，其中酶结构的改变及位阻效应的影响可以通过校正动力学参数（如Km和Vm）来体现。 分配效应则可以利用相平衡理论来描述，例如用液固界面内外侧的底物浓度比（分配系数）Kp来定量表示 Kp=[Sg]r=R/[SS] [Sg]r=R为紧靠固液界面内侧底物的浓度，[SS]是紧靠外侧底物的浓度。 扩散效应可用传质理论来进行数学描述。引入有效因子来阐述传质对反应的影响。 有效因子 Η=（有扩散影响时的实际反应速率/无扩散影响时的实际反应速率） 固定化酶在传感器方面的应用 酶传感器是由固定化酶与能量转换器(电极、场效应管、离子选择场效应等）密切结合而成 已经广泛应用于临床诊断、工业发酵控制、环境监测等。目前研究、应用最多的是酶电极 酶电极用于组分分析，特点是快速、方便、灵敏、精确 目前，酶电极已经用于各种糖、抗生素、氨基酸、甾体、有机酸、脂肪、醇类、胺类、尿素及无机酸等分析 固定化酶或细胞在食品工业中的应用 糖类转化 例如葡萄糖异构酶，转化糖生产，乳糖分解 氨基酸生产 例如L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-瓜氨酸等12种 醇（酒）类生产 例如乙醇、异丙醇、正丁醇等 固定化细胞在工业上的应用 有机酸的生产 例如乙酸、柠檬酸、乳酸、赤藓酸、泛酸、水杨酸、苹果酸、多种氨基酸等 有机物降解 酚、尿素、青霉素、链霉素等 合成药物 类固醇氢化可的松等 酶及代谢物 α-淀粉酶、谷胱甘肽、NADP+、磷酸吡哆醇、葡萄糖-6-磷酸 分析 BOD、测定、乙酸分析、烟酸分析 固定化酶（细胞）的应用趋势 碳水化合物氧化 例如丙烯酸氧化、生产H2 固氮作用 污水处理 例如反硝化作用、生成甲烷 其它方面 蛋白质亲和层析、燃料电池、生物发光、制乙烯、光学拆分