一株微生物采油菌的16SrDNA鉴定和绿色荧光蛋白分子标记.doc

 第 ２６ 卷 第 ４ 期 Ｖｏｌ．２６ Ｎｏ．４ 徐 州 工 程 学 院 学 报 （自 然 科 学 版 ） Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｘｕｚｈｏｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｄｉｔｉｏｎ） ２０１１ 年１２ 月 Ｄｅｃ．２０１１ 一株微生物采油菌的 １６ＳｒＤＮＡ 鉴定和绿色荧光 蛋白分子标记 王 欲 晓１，庄 文 昌１，王 靖２ （１．徐 州 工 程 学 院 ，江 苏 徐 州 ２２１００８；２．中 国 石 油 大 学 化 工 学 院 ，北 京 １０２２４９） 摘 要 ：筛选到一 株 高效生产多糖的 ＹＸ 菌 ，油田先导试验证明该菌可 以 用于微 生 物 调 剖 提 高 原 油 采 收 率 （ＭｉｃｒｏｂｉａｌＥｎｈａｎｃｅｄＯｉｌＲｅｃｏｖｅｒｙ，ＭＥＯＲ）．经 １６ＳｒＤＮＡ 分 析 鉴 定 ，ＹＸ 菌 属 于 肠 内 杆 菌 属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ．），为跟 踪 监测其动态信息 ，构 建 表达绿色荧光蛋白 （ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ， ＧＦＰ）的 重 组 质 粒 ｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＥＧＦＰ，利 用 ＣａＣｌ２ 法 将 其 转 化 至 ＹＸ 菌 ，利用荧光显微镜可以观 察 到 重 组 ＹＸ（ＧＦＰ）工 程 菌 的 绿 色 荧 光 ．结 果 表 明 ＹＸ 菌可以被绿色荧光蛋 白 基 因标 记 ，用 于 微 生 物 采 油 研 究 ． 关 键 词 ：微 生 物 采 油 菌 ；１６ＳｒＤＮＡ 鉴 定 ；绿 色 荧 光 蛋 白 ；重 组 质 粒 中 图 分 类 号 ：Ｑ７８９ 文 献 标 志 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１６７４－３５８Ｘ（２０１１）０４－００５６－０５ 微 生 物 提 高 原 油 采 收 率 （ｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｎｈａｎｃｅｄｏｉｌｒｅｃｏｖｅｒｙ，简 称 ＭＥＯＲ）是 一 种 新 型 提 高 原 油 采 收 率 的 方 法 ．它 适 用 范 围 广 、工 艺 简 单 、投 资 少 、见 效 快 、功 能 多 、无 污 染 、注 入 的 微 生 物 和 营 养 物 既 便 宜 又 容 易 获 得［１］，在 矿 场 条 件 下 易 于 监 测 ，是目前具有发展前景的一项采油 技 术 ．从 ２０世 纪 ５０年 代 起 ，前 苏 联 和 东 欧 一 些国 家进 行了多次 微生物采油现场试验 ，普 遍 取 得 成 功 ，结果表明细菌 采 油对 低 产 井 效果较好［２］． 筛 选 优 秀 菌 种 是 ＭＥＯＲ 技 术 的 关 键 所 在 ，１６ＳｒＤＮＡ 的 快 速 分 析 鉴 定 可 以 了 解 菌 种 的 种 属 关 系［３］，而 荧光 标记 可以快速 跟踪和研究优势菌的动 态 信 息 ，更 好 的 为 ＭＥＯＲ 技 术 服 务 ．１９９２ 年 Ｐｒａｓｈｅｒ等［４］克 隆 了 ＧＦＰ 基 因 的 ｃＤＮＡ，并 分 析 了 ＧＦＰ 的 一 级 结 构 ；１９９４年 Ｙｏｕｖａｎ 等［５］首 次 在 大 肠 杆 菌 细 胞 和 线 虫 中 表 达 了 ＧＦＰ．目 前 研 究［６－７］表 明 ，绿 色 荧 光 蛋 白 ＧＦＰ 可以作为分子标记物 ，通 过 基 因 工 程 手 段 ，在 不 影 响 微 生 物 自 身 性 状 的 前 提 下 ，导 入 生 物 体 ，使得新构建的生物产生易于观察的现象 ． 材 料 与 方 法 材 料 １ １．１ 菌 种 和 质 粒 １．１．１ ＹＸ 菌 ，本 实 验 室 筛 选 ，可 以 高 效 生 产 多 糖 ，用于微生物采油 ．Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１，购 自 Ｎｏｖａｇｅｎ 公 司 ，用 于 高 效 转 化 外 源 基 因 的 菌 株 ．质 粒 ｐＧＭ－Ｔｅａｓｙ，购 自 华 美 生 物 技 术 公 司 ，克 隆 载 体 ，用 于 高 效 率 连 接 ＰＣＲ 产 物 ． 包 含 ＧＦＰ 基 因 的 重 组 质 粒 ｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＥＧＦＰ，Ｋｍｒ，本 实 验 室 构 建 ． 培 养 基 和 主 要 试 剂 １．１．２ 完 全 培 养 基 （ｇ／Ｌ）：蛋 白 胨 １０ｇ，葡 萄 糖 １０ｇ，酵 母 粉 ５ｇ，牛 肉 膏 ５ｇ，ＮａＣｌ５ｇ，ｐＨ 值 ７．２；ＬＢ 培 养 基 （ｇ／Ｌ）：胰 蛋 白 胨 １０ｇ，酵 母 粉 ５ｇ，氯 化 钠 １０ｇ，ｐＨ ７．０～７．２；ＬＢ 加 葡 萄 糖 液 体 培 养 基 ：ＬＢ 培 养 基 加 葡 萄 糖 ２０ｇ． 限 制 性 内 切 酶 ＮｃｏⅠ、ＳａｌⅠ、ＥｃｏＲⅠ ＴａＫａＲａＥｘＴａｑＰｒｅｍｉｘ、ＰＣＲｆｒａｇｍｅｎｔｒｅｃｏｖｅｒｙｋｉｔ、ＤＮＡ Ｍａｒｋ－ ｅｒＤＬ１５０００购 自 大 连 ＴａＫａＲａ；Ｓ