测定核苷酸方法的研究前沿.doc

核苷酸测定方法研究进展 王添琦，吴海棠，王慧，谭光国，娄子洋* （第二军医大学药学院 上海市 200433） 摘要：核苷酸是重要的代谢物组分，它们不仅是DNA和RNA的母体而且在代谢中扮演重要角色，例如存储和转运代谢的能量与细胞的信号，并且参与了辅酶因子的反应。因此，精确地测定生物样品中核苷酸的含量对于研究生物体内的能量代谢提供了重要的信息。尽管目前有很多种方法用于核苷酸的测定，但是由于分辨率低、分析时间长、色谱柱再生等原因结果不尽如人意。本文在研究分析国内外相关研究的基础上，总结了常用的测定方法的原理以及其优缺点。 关键词：核苷酸、前处理技术、分析技术、综述 Development of the detection methods for nucleotides Wang Tian-qi, Wu Hai-tang, Wang Hui, Tan Guang-guo, Lou Zi-yang* (School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China) Abstract: An important group of metabolites are the nucleotides, they are the precursors of DNA and RNA. In addition, they fulfill central roles in metabolism, such as storage and transport of metabolic energy and cellular signaling, and are incorporated into cofactors of enzymatic reactions. Therefore, there have been strong demands for sensitive and reliable analysis method of the nucleotides in the samples because their cell concentrations may provide valuable information of energy metabolism. Considering the various methods for determine of nucleotide, the frustrating fact is the low resolution, the long analysis time and the column regeneration. On the Basis of relevant research at home and abroad, the article review the function of the analysis methods and their advantages and disadvantages. Key word: nucleotides, pre-condition technology, analysis technology, review 1.前言 核苷酸是生物体内重要的低分子化合物，具有许多生理功能，除作为DNA、RNA的前体，也作为生理、生化过程的调节物质参与体内物质代谢。(再生)，分析时间较长；反相液相色谱法，具有快速、操作方便的优点；毛细管电泳技术以其快速、高效、污染小等特点发展迅速，已应用到核苷酸的测定中。本文综述了近几年来核苷酸分析方法的研究进展，在分析其各自原理的基础上主要对比了它们在应用于测定核苷酸上优缺点。 2. 分析技术 2.1 前处理技术 对于生物样品的测定，前处理步骤是至关重要的，它决定了分析结果是否准确可靠。通常前处理技术包括淬灭和代谢物的提取两步。淬灭就是通过快速抑制酶活性，使代谢反应停止。由于核苷酸含量会随着环境的改变或者转化在几秒内发生剧烈的变化，所以要采取有效地淬灭方法快速抑制酶的活性从而准确地测定其含量。常用的淬灭方法有快速加入冷的缓冲液或加入冷的有机溶剂淬灭，例如，应用预冷的-40℃的60%甲醇（v/v）作为淬灭试剂的方法[1]。 样品淬灭后，需要尽快对样品中代谢物进行提取。可以通过高温、极端的PH、有机溶剂、机械压力等方法进行代谢物的提取，其中一些提取方法如高氯酸（PCA）[2]，热水（HW）[3]，和热乙醇（BE）[4]等很早就应用于核苷酸类、葡萄糖类、有机酸类和氨基酸类等成分的提取；有文献[7]通过分别考察了热水、热乙醇、氯仿-甲醇、甲醇中冻融循环、酸性乙腈-甲醇共5种不同的提取方法，对啤酒酵母中的44种代谢产物（包括核苷酸类）