秦岭地区子囊菌酵母物种多样性研究_cropped.doc

 菌 物 学 报 23（2）：183~187, 2004 Mycosystema 秦岭地区子囊菌酵母物种多样性研究 白逢彦* 陆惠中 王启明 贾建华 (中国科学院微生物研究所真菌地衣系统学重点实验室 北京 100080) 摘 要：从陕西秦岭地区的果实和叶等不同基物上分离得到子囊菌酵母 262 株，利用 26S rDNA 的 D1/D2 区域序列分析并结合形态学特征对这些菌株进行了分类学研究，探讨了该地区子囊 菌酵母的物种多样性及其分布。共鉴定出 10 属 31 种，其中优势属为假丝酵母属 Candida, 12 种，(其中新种 2 个，另文发表)、酿酒酵母属 Saccharomyces, 5 种、毕赤酵母属 Pichia, 5 种和 有孢汉逊酵母属 Hanseniaspora, 3 种。对分离自陕西秦岭不同地区与海拔的同一个种的不同菌 株进行了 D1/D2 序列分析比较，以探讨子囊菌酵母种内序列稳定性和变异幅度。 关键词：陕西，优势酵母属种，地理分布，26S rDNA D1/D2 区，序列分析 中图分类号：Q939.96 文献标识码：A 文章编号：1672-6472（2004）02-0183-0187 秦岭被视为中国亚热带和暖温带的分界山脉，山谷纵横，高温多变，气候温和湿润，生 物资源丰富，有着从热带阔叶林向暖温带夏绿阔叶林过渡的植被景观。1991－1997 年间中科 院微生物所对秦岭地区的真菌进行了系统的考察研究，发现了该地区具有丰富的真菌资源（卯 晓岚和庄剑云主编，1997）。然而，对该地区子囊菌酵母的系统研究还是空白。基于此，我们 对位于陕西界内的秦岭部分区域，包括秦岭主峰太白山（3767 米）的子囊菌酵母进行了考察。 酵母菌的常规鉴定主要依赖于形态和生理特征，然而，这些特征均是表型性状，且会随 着环境的变化有所改变，造成菌株鉴定的不可靠性（白逢彦，2002）。随着 DNA 序列分析技 术的日趋成熟和简易化，rRNA 基因（rDNA）及其转录间区（ITS）的序列分析已经被广泛 应用于酵母菌的鉴定。Kurtzman 和 Robnett（1997，1998）和 Fell 等（2000）的研究表明 大亚基 rRNA 基因（26S rDNA）中的 D1/D2 区域能将绝大部分子囊菌酵母和担子菌酵母的种 区分开来，而种内不同菌株间 D1/D2 区域序列差异一般在 1%以内，碱基差异在 1%以上则可 能代表不同的种。由于这些序列均已经公布于 GenBank/EMBL/DDBJ 等国际核酸序列数据库， 为酵母菌的鉴定带来极大的便利。本研究利用 D1/D2 序列分析，并结合表型性状，探讨了中 国陕西秦岭地区子囊菌酵母的物种多样性和分布。 1 材料与方法 1.1 样品采集和酵母菌分离 于 2002 年 10 月上旬，赴陕西秦岭地区采集主要以果实和树叶为主的基物。取适量基物 放于富集培养基（用浓 HCl 调至 pH 3.5-4.0 的麦芽汁液体培养基）中 25 °C 下进行富集培养， 2~3 天后过滤涂布麦芽汁琼脂平板，25 °C 下培养 2~3 天后挑取单菌落。纯化后用标准方法 国家 863 项目(2001AA227131)和中科院知识创新工程重要方向项目(KSCX2 -SW -101C)资助 * 通讯作者, e-mail: baify@sun.im.ac.cn 收原稿日期：2003 -11 -27 ，收修改稿日期：2004 -01 -17 （Yarrow, 1998）进行尿素酶测试，阴性反应者为子囊菌酵母。分离出的酵母菌放在-80 °C 超 低温冰箱中保藏备用，已鉴定菌株交中科院微生物研究所中国普通微生物菌种保藏中心 （CGMCC）保藏。 1.2 形态学观察 根据酵母菌分类学研究标准方法（Yarrow, 1998）对供试菌株进行形态学观察。 1.3 DNA 提取、PCR 扩增和测序 DNA 提取按照 Makimura 等（1994）的方法进行，详细步骤见白逢彦等（2002）。26S rDNA D1/D2 区域序列的 PCR 扩增根据 Kurtzman Robnett （1997）的方法，用引物 NL1 （5-GCA TAT CAA TAA GCA GAG GAA AAG-3）和 NL4 （5-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3） 扩增所测菌株的 D1/D2 区域，按下述反应条件进行 36 个循环：94 °C, 1 min; 55 °C, 1 min; 72 °C, 2 min。所得 PCR 产物纯化后用引物 NL1 和 NL4 在 ABI 377 型 DNA 自动测序仪上直接 测序。 1.4 序列分析 用校正后的所测菌株的 D1/D2 序列，在 GenBank/EMBL/DDBJ 等国际