2011级微生物工程复习要点.doc

2011级研究生“微生物工程”复习要点工业菌种改良的方法有哪些？ 基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性，有哪些方法，其原理是什么？ 什么是微生物的生物转化？有什么特点？微生物转化的一般过程？ 分解代谢物阻遏作用与环腺苷酸（cAMP）的浓度有什么关系？ 比较单级萃取、多级错流萃取、多级逆流萃取的优缺点？ 论述超临界CO2萃取技术的应用前景与存在问题。 近年来，许多行业对利用超临界CO2流体萃取技术分离物质的组分进行了大量研究。在萃取设备和分析技术都有了较大的进步。在萃取成分分析方面，已采取萃取设备与GC、IR、MS、LC等联用，实现了提取、分析、质量检测一体化。能快速准确地反应出萃取物的结构、浓度和纯度。 所有研究都是从研究分析超临界二氧化碳萃取的主要工艺参数(压力、温度、时间、CO2流量、物料粒度)和辅助工艺措施(加入辅助溶剂、控制温度及压力的升降方式)对萃取效果的影响，找出理想的工艺条件，对比常规物质组分分离方法，证明了该技术对某些物质分离的优越性。 从这些研究中可以看到，该技术在我国的研究及应用已扩展到许多行业，获得了大量研究成果和技术资料，研究水平也在不断提高。其在天然产物的深加工及中药现代化领域具有广阔的前景。 作为超临界CO2萃取装置中的关键设备，萃取釜和高压泵有什么特殊要求？ ？？？？ 1、外源基因自身的影响外源基因的特性是决定表达成败的首要因素。外源基因序列中mRNA 5端非编码区(5r-UTR)的序列和长度影响外源基因的表达。适当长度的5’非翻译区可极大地促进mRNA有效地翻译，5-UTR太长或太短都会造成核糖体40 S亚单位识别的障碍。酵母菌对外源基因的表达也和外源基因密码子的选用有关。如果外源基因密码子中存在过多的宿主低利用密码子，位于起始密码子附近 的低利用密码子对基因的表达就会产生很大影响。2、表达框的染色体整合位点和方式 Pp没有天然质粒，所以设计表达载体偏向于染色体整合，通过同源重组，载体整合到细胞染色体中间。整合性载体具有表达框稳定和可控制整合位点等优越性，并且能够发生多位点整合而获得多拷贝。3、宿主的甲基营养表型：Mut+或Muts Mutaox1基因在甲醇限制性培养基上生长缓慢它们只能利用弱的aox2启动合成AOX；而aox1基因完整的酵母则生长正常(Mut＋)。原则上，如果是胞内表达，应尽量用Mut－细胞，这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量相对较多使下游纯化更易进行。4、基因剂量基因拷贝数对表达量的影响是无法预测的。高表达菌株的筛选只应以表达的蛋白量为唯一标准。5、分泌信号对于一个原本就不能分泌的蛋白来说，采用分泌方式生产是非常困难甚至是不可能的。但为了下游工程处理的方便，外源蛋白的生产应尽量考虑采用分泌表达的方式6、培养条件的影响 培养条件主要包括培养基、通气量、pH值、甲醇含量等。培养基主要对生物量和诱导表达有影响。充足的通气量对于诱导阶段外源蛋白的表达极其重要，应该保持高通气量。甲醇诱导的方式、用量、诱导时间都会影响外源蛋白的表达水平。酵母细胞膜上有一种KEX-2样蛋白水解酶，能专一性水解a因子前体中羧基端的肽键酵母基因工程表达产物发生降解现象如果基因工程产物会影响宿主菌生长代谢活性的话，也可能出现高度降解的情况。一般情况下Pp能产生较酿酒酵母明显要短的高甘露糖型寡糖链，且较均一，长度在8－14个之间，使产物更加稳定，虽然糖基化对某些外源蛋白的活性没有太大影响，它却可能在蛋白折叠和抗蛋白酶降解中起重要作用。 中药发酵研究开始于80年代,但仅是对真菌类自身发酵的研究,如灵芝菌丝体、冬虫夏草菌丝体等,大都是单一发酵。90年代初,日本人小桥恭一发现中草药成分如番泻叶甙,可借助肠道细菌转化为致泻有效成分而起到治疗作用。中药成分的生物转化是中药创制新药研究的重要方面。1)加强功能微生物的菌种选育工作不再采用自然酵母菌类,而应进行广泛筛选。我们采用人体内存在的有益菌群为菌种,这些有益菌群自身在胃肠道中就有重要的生理活性作用2)利用中药发酵技术及装备研究菌群的生长和繁殖状况3)发酵中药的组方及药理活性研究;4)复合微生物发酵技术研究;5)建立有效的筛选模型;6)应用现代化学分析技术,建立快速灵敏的分析检测手段;7)在研究发酵中药过程中如何贯彻中医理论的指导并吸收现代中医药的其他新成果。 1