2第二章 基因工程制药（一）.ppt

第二章 基因工程制药 第二章 基因工程制药(一） 一、概述 生物技术的核心就是基因工程，基因工程技术最成功的应用就是用于生物治疗的新型生物药物的研制。 传统生物药物由于来源及制备上的困难、价格等因素的影响，此外在制备过程可能受到的病毒、衣原体、支原体等的感染等问题，促使人们寻求安全、实用、疗效可靠的新方法来制备生物药物。 应用基因工程技术可十分方便且有效地解决上述提到的问题，从量、质上都可以得到改进，且可以创造全新物质。 癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分泌等方面的预防、治疗和诊断已可通过基因工程技术获得。 利用基因工程技术生产的药物 包括医用活性蛋白和多肽： 免疫性蛋白，各种抗原和单克隆抗体； 细胞因子，干扰素、白介素、生长因子； 激素: 胰岛素、生长激素； 酶类: 尿激酶、链激酶、蚓激酶、超氧化物歧化酶。 利用基因工程技术生产药物的优点 可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障； 可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围； 利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质； 利用基因工程技术生产药物的优点 内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除； 如白细胞介素-2的第125位半胱氨酸是游离的，有可能引起-S-S-键的错配而导致活性下降，如将此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，白细胞介素-2的活性以及热稳定性均有提高； 可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 二、基因工程药物生产的基本过程 基因工程技术就是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。 基因工程药物制造的主要程序 基因工程药物生产的上游和下游技术 上游技术：主要指的是目的基因分离、工程菌（或细胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成； 下游技术：主要指的是从工程菌（或细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等。 三、目的基因的获得 对于原核生物，其基因总量不大，可以选用合适的限制性核酸内切酶切下目的基因。 对于真核生物不能进行直接分离。真核细胞中基因总量较大，从染色体中直接分离纯化目的基因极为困难。 另外，真核基因一般都有内含子，如果以原核细胞作为表达系统，即使分离出真核基因，由于原核细胞缺乏mRNA 转录后的加工系统，真核基因转录的mRNA 也不能被加工、拼接成为成熟的mRNA ，因此不能直接克隆真核基因。 克隆真核基因的方法 逆转录法 化学合成法 什么是逆转录法 先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成互补cDNA，然后进行互补cDNA 的克隆表达。 从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质mRNA的互补DNA(complementary DNA )，再以互补DNA 为模板，在逆转录酶或DNA 聚合酶作用下，最终合成编码该蛋白质的双链DNA 序列。 该序列不含内含子。 逆转录法的步骤 mRNA的纯化 cDNA第一链的合成 cDNA第二链的合成 cDNA克隆 将重组体导入宿主细胞 cDNA文库的鉴定 目的cDNA克隆的分离和鉴定 mRNA 的纯化 细胞内含有三种RNA，mRNA 占RNA 总量的2%-5%，相对分子量大小不一致，分离也有很大的困难。 但是mRNA 的3’末端常含有一多聚腺苷酸（polyA）组成的末端，长达20-250 个腺苷酸，足以吸附于寡聚胸苷酸（Oligo dT）-纤维素上，从而可以用亲和层析法将mRNA 从细胞总RNA 上分离出来，可得到纯度较高的mRNA。 mRNA 的纯化 用高浓度盐溶液使mRNA特异结合于寡聚dT。 再以低盐溶液和蒸馏水将其洗脱，经过两次寡聚dT，可得到较纯的mRNA。 cDNA第一链的合成 一般mRNA都带有3‘-polyA，所以可用寡聚dT作为引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNA链的合成。 在合成反应体系中加入一种放射性标记的dNTP，在反应中以及反应后可通过测定放射性标记的dNTP掺入量，计算出cDNA的合成效率。 cDNA第一链的合成 在凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物的分子大小，探索最佳反应条件。 一次好的逆转录反应可使寡聚dT选出的mRNA有5%~30%被拷贝。 cDNA第二链的合成 先用碱解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链，然后以cDNA第一链为模板合成第二链。 由于第一链cDNA链3‘末端往往形成一个发夹形结构，所以，可以从这一点开始合成cDNA第二链。 cDN