第5章 层析技术.pptVIP

第五章 层析技术 一、概念 层析技术： 又称色谱技术（Chromatography），是一种根据被分离物质的物理、化学及生物学特性的差异，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。 二、原理 层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质。 当待分离的混合物通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与固定相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在固定相中的分配（含量对比）不同。 与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分步收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。 三、分类 根据流动相的形式分类，层析可以分为液相层析和气相层析。? 根据固定相基质的形式分类，层析可以分为纸层析、薄层层析、薄膜层析和柱层析。 根据分离的原理不同分类，层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。 A 离子交换层析 ion-exchange chromatography 1 离子交换层析的基本原理 离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。 2 离子交换介质的基本性质 2.1离子交换介质的基本性能 离子交换介质亦称离子交换剂，通常是一种不溶性高分子化合物如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等。 离子交换反应发生在离子交换介质上的具有可交换离子的活性基团上。 离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用。 2 离子交换介质的基本性质 2.1离子交换介质的基本性能 吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变pH使吸附的蛋白质失去电荷解离下来，离子交换反应是可逆反应。 不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。 阳离子交换介质：强酸型和弱酸型 可电离的基团 磺酸基（-SO3H） 磷酸基（-PO3H2） 羧酸基（-COOH） 酚羟基（-OH） 阴离子交换剂：强碱型和弱碱型 可电离的基团 伯胺基（-NH2） 仲胺基（-NHCH3 ） 叔胺基（-N(CH3)2） 季胺基（-N+(CH3) 3 ） 强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽。 弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小。 弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱。 弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱。 2.3.1 离子交换树脂 最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物。 离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大，因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化。 离子交换树脂使用后需要进行再生处理。 根据活性基团的不同、离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两大类。 a. 阳离子交换树脂 阳离子交换树脂具有酸性基团，如应用最广泛的强酸性磺酸型聚苯乙烯树脂，它是以苯乙烯和二乙烯苯聚合，经浓硫酸磺化而制得的聚合物。 这种树脂的化学性质很稳定，具有耐强酸、强碱、氧化剂和还原剂的性质，因此应用非常广泛。 各种阳离子交换树脂含有不同的活性基因、常见的有磺酸基(-SO3H)、羧基(-COOH)和酚基(-OH)等。 根据活性基团离解出H+能力的大小不同，阳离子交换树脂分为强酸性和弱酸性两种。例如含-SO3的为强酸性阳离子交换树脂，常用R-SO3H表示(R表示树脂的骨架)，和-COOH和-OH的弱酸性阳离子交换树脂，分别用R-COOH和R-OH表示。 强酸性阳离子交换树脂应用较广泛，弱酸性阳离子交换树脂的H+不易电离，所以在酸性溶液中不能应用，但它的选择性较高而且易于洗脱。 b. 阴离子交换树脂 阴离子交换树