第6章 凝胶亲和层析.pptVIP

第六章 凝胶亲和层析 B 凝胶层析 gel-filtration chromatography 1 凝胶层析的基本原理 凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为分子筛，凝胶/分子筛排阻层析。 凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定以及除去热原物质分离纯化。 操作简便，分离效果好，重复性高，回收率高，分离条件温和。 分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之外，即全排阻；两种全排阻的分子即使大小不同，也不能分开；它们下行速度快。 分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能进入凝胶颗粒的全部孔隙即使大小不同也不能分开；它们的下行速度慢。 2 凝胶介质的基本性质 2.1分类 葡聚糖凝胶 Sephadex G-系列 聚丙烯酰胺凝胶 Sephacryl系列 琼脂糖凝胶 Sepharose系列 Superose系列 葡聚糖凝胶的种类有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200，G50即表示每克干凝胶的吸水量为5.0毫升。 葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解。 湿态的葡聚糖可加热到110℃，干的则能耐受120℃高温。 Sephadex LH是羟丙基化的Sephadex，这类层析介质的流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用于非水溶性溶质的凝胶过滤 。 琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有Sepharose（ Sepharose 2B、4B、6B，数字代表干胶的百分比 ）和Bio-Gel-A等（Bio-Gel-A 0.5M、1.5M、5M、15M、50M、150M，数字X106代表排阻限度。 当温度高于50℃时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温度下使用。 琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大分子物质（如蛋白质和DNA）。 Sepharose CL是二溴丙醇交联的琼脂糖，其孔径大小和分离范围与普通琼脂糖一样，但热和化学稳定性增加，能高温消毒。 聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交联剂越多，孔隙越小。 聚丙烯酰胺凝胶的商品名为Bio-Gel，型号从P-2至P-300共10种（ 数字X1000就相当于该凝胶的排阻限度）。 凝胶介质的选用原则 组别分离 将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为组别分离，其分离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。 组别分离一般选用Sephadex G-25或G-50，对于小肽和低分子量的物质（分子量范围1000-5000）的脱盐可选用Sephadex G-10、G-15、Bio-Gel P-2或P-4。 将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫分级分离。 该策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。 分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。 C 亲和层析 affiuity chromatography 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术，它有如下特点： 纯化过程简单、迅速，且分离效率高 特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子 纯化倍数大，产物纯度高 必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件 因此应用范围受到一定的限制 亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂 当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出 然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来 实例：亲和层析法制备谷胱甘肽转硫酶 谷胱甘肽转硫酶（Glutathion S-transferases，简称GSTs，EC2.5.1.18）广泛存在于动物和人体的各种组织，哺乳动物肝脏中含量最高，约占肝可溶性蛋白的10%。GST是机体内一组具有重要解毒作用的同工酶家族，均为由两个亚基组成的二聚体，相对分子质量为45 000—49 000，各同工酶的等电点不同，多为碱性同工酶。 亲和层析法分离GST的试剂 缓冲液A：0.025mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3mmol/L二硫苏糖醇（DTT），1mmol/L EDTA，0.2m