第八章 沉析.pptVIP

常用的有机溶剂沉析剂 乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析； 丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广； 特点： 介电常数小，60%乙醇的介电常数是48 丙酮的介电常数是22 容易获取 有机溶剂沉析的特点 溶剂容易分离，并可回收使用； 产品洁净； 容易使蛋白质等生物大分子失活； 成本高 溶剂选择 介电常数要小 致变性作用要小（甲醇） 毒性要小、挥发性适中 水溶性要好 影响有机溶剂沉析的主要因素 温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度下降）； 搅拌速度：散热；防止局部过浓； 溶液pH值：原则是避免目标蛋白与杂质带有相反的电荷，防止共沉现象。（pI） 离子强度:离子强度低有利于沉析，0.01~0.05mol/L 样品浓度: 0.5~2% 稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小 浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低 金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+ 等电点沉淀 原理： 蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。 概念： 调节体系pH值，使两性电解质的溶解度下降，析出的操作称为等电点沉淀。 由于在等电点附近，溶质仍然有一定的溶解度，等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，因此等电点沉淀法通常与盐析、有机溶剂沉淀法联合使用。 操作时的注意事项： （1）由于无机离子的影响，蛋白质的等电点通常会发生“漂移”，阳-高，阴-低。 （2）蛋白的稳定性（调节pH时） （3）盐析效应（pH不变，高离子强度；离子强度不变，pH变） 从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝8.9，可先于pH 3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3.0)。工业生产胰岛素(pI＝5.3)时，先调pH至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。 其它沉淀法 水溶性非离子型聚合物沉淀剂：常用非离子型聚合物为分子量为2000—6000的聚乙二醇（PEG）。 原理与有机相似。 使用PEG沉淀分离蛋白质方法的优点是：1 体系的温度只需控制在室温条件下；2 沉淀的颗粒往往比较大，同其他方法相比，产物比较容易收集；3 PEG非但不会使蛋白质变性而且可以提高它的稳定性，但也有报道说它会使有些蛋白质不稳定。 PEG沉淀分离蛋白质的缺点是：PEG比其他沉淀剂更难从蛋白质溶液中除去，为此需用超滤和液－液萃取来解决。 成盐类复合物沉析剂 1） 重金属可能导致蛋白的不可逆沉淀！！！ 离子型表面活性剂：CTAB（沉糖）、SDS等； 离子型多聚物沉析剂：是一类温和的沉析剂，与目标蛋白成盐。 核酸（多聚阴离子），用于碱性蛋白的沉淀； 鱼精蛋白（多聚阳离子），用于酸性蛋白的沉淀； 粘多糖沉淀剂 CTAB(十六烷基三甲基季铵盐溴化物) 与多糖上的阴离子形成形成季铵络合物，降低离子强度，络合物析出。 分离核酸用沉析剂 酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等 目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸则存在于水溶液中。 选择性变性沉淀法 利用蛋白质、酶、核酸等生物大分子对某种物理或化学因素的敏感性差异，实现分离。 加入变性剂 选择性热变性 选择性酸碱变性 使用时需慎重！ 过程分6个步骤： ①初始混合，蛋白质溶液沉析剂在强烈搅拌下混合。 ②晶核生成，新相形成，产生极小的初始固体微粒。 ③扩散限制生长，晶核在Brownian扩散作用下生长，这一步速度很快。 ④对流引起的生长，晶核通过对流传递(搅拌)引起的碰撞进一步生长，产生絮体或较大的聚集体，这一步是在较低的速度下进行的。 ⑤絮凝，晶核进一步的生长聚集。 ⑥收集。 大规模沉析 溶解度是一个平衡特性，但是溶解度值的降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚集作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起：①热运动 (Brownian运动)；②对流运动，由机械搅拌产生； ③差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。其中第①、②两种机理在蛋白质沉淀中起主导作用，第③种机理在沉降过程中起主导作用(如在废水处理中)。 本章作业 常用的蛋白质沉淀方法有哪些？各方法的原理是什么？ * 第八章 沉 析 利用沉析剂使所需提取的生化物质或杂质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。常用于生化物质的分离纯化。 特点：操作简单、经济、浓缩倍数高； 种类：盐析、有机溶剂沉析、等电点沉析等； 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强。 可进行浓缩； 初步纯化； 将高纯液体固化。 是一种最古老的方法，但是目前