高效液相色谱使用与维护经典全面.pptVIP

妩媚人生 / 高效液相色谱的使用与维护 浙江省疾病预防控制中心 蔡增轩 液相色谱仪器部件 日常维护 色谱图相关术语 实验操作与应用 一些商品化仪器 　　　　　　　　　　　　　ｄｉoｎeｘ 良好的接地专门房间定制台面不间断电源HPLC的日常操作条件：　　温度：10～30℃,最好是恒温； 空调器 　　相对湿度80％,最好是恒湿; 除湿机　　远离高电磁干扰、高振动设备; 　　有良好的通风设施; 通风罩 HPLC的环境设置： 高效液相色谱仪组成 输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据记录处理系统 HPLC 液相色谱的流动相 2. 流动相类别 3. 流动相选择 液相色谱中的溶剂强度 洗脱强度与溶剂极性 溶剂强度图 混合溶剂的极性 溶剂选择性分类 流动相的优化 4.流动相的组成 水相 纯水 缓冲溶液 有机相 纯有机相 混合有机相 缓冲有机相 对溶剂的要求 水： 去离子水 自动纯水仪 重蒸水 重蒸水装置 　　　纯净水　　 商品瓶装水 有机溶剂: 色谱纯（国产、进口、进口分装） 　　　重蒸　　　　　旋转蒸发仪 过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。 脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响： 1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动 无在线脱气应注意： 1）每天脱气 2）如使用氦脱气，对混合溶剂脱气时间不能过长 选择流动相时应注意的几个问题 色谱泵及液相色谱对泵的要求 稳定平滑并且重现性好的流速 可靠且充分的溶剂混合 准确及重现的自动溶剂混合 准确及重现的梯度形成 有效的流速范围 制备色谱或微柱、窄柱色谱更为关注 滞后体积 仅仅应用于梯度实验 目的：在任何情况下保持最高精度 主动式单向阀(电磁阀） 梯度洗脱技术 1．梯度洗脱的特点 2．梯度洗脱的主要条件 梯度洗脱的基本原理 梯度操作注意事项： 梯度：高压混合 高压梯度 使用多台色谱泵，在泵后混合 配置灵活、简单，脱气简单 易调节梯度的滞后体积 梯度：低压混合 低压梯度 用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合 对脱气要求高 不易调节梯度的滞后体积 如设计不当，梯度的准确性受影响 滞后体积（系统体积）设计合理 梯度洗脱 梯度滞后：系统体积的影响 梯度滞后大小的影响 滞后体积太大会引起梯度变化的延迟 例如：滞后体积为2.0ml，流速1.0ml/min 实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应，没有问题 对微柱色谱影响更大，同上例但流速0.1ml/min 实际梯度会比设置值晚20 分钟响应，不能接受 滞后体积的不同会使方法转换麻烦 滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现 滞后体积的变化会导致梯度重现性不好 普通分析型液相色谱的滞后体积为2~4ml 滞后体积变化的影响 设计不好的HPLC系统，滞后体积随反压变化 滞后体积随反压变化的后果： 梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好 用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性 色谱柱的结构 大孔径填料适用于大分子分析 大孔径300? 全多孔色谱柱 可用于分离蛋白质和多肽 分子量虽小但hydrodynamic volume(水动力学体积)较大的分子 Poroshell 色谱柱 高流速下, 高柱效分析大分子的蛋白质和多肽 300? 孔径可改善蛋白质和多肽峰形 300? 孔径可改善大分子的峰形 液相柱---保留值与pH的关系 液相柱---保留值与pH的关系 液相柱---保留值与pH的关系 液相柱---保留值与pH的关系 液相柱---保留值与pH的关系 复杂组分的流动相pH选择技巧 柱性能测试 : 应指定色谱条件和检测物质 液相色谱的检测器 常规检测器 示差折光检测器（Refractive Index） 紫外/可见光吸收检测器（UV-Vis） 荧光检测器（Fluorescence） 蒸发光散射检测器（Evaporative Light Scattering） 其他检测器（Other Detectors） 高端检测器 光电二极管矩阵检测器（Photod