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主要内容 一.PCR技术的发明 二.PCR技术原理 三.PCR反应组分及反应条件 四.PCR实验操作 五.PCR应用 六. TaKaRa PCR Cycler Dice TP650 DNA双螺旋结构的发现 v20世纪50年代初，威尔金斯等意识到DNA是一种螺旋结构。 v1951年底，弗兰克林在拍摄到一张清晰的DNA的X射线照片。 v1952年，鲍林发表关于DNA三链模型的研究报告。 v1953年3月7日，沃森和克里克成功搭建DNA双螺旋模型。 v1953年4月25日，沃森和克里克在《自然》杂志上发表名为“核酸的分子结构--DNA的一种可能结构”的论文，阐明DNA双螺旋结构及碱基配对和半保留复制机理。 上世纪最重要的三个重大发现之一 沃森克里克 v 20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术，但由于核酸的含量较少，在一定程度上限制了DNA的体外操作。 v1971年Khorana最早提出核酸体外扩增的设想： DNA经过变性，与引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程，便可合成tRNA基因。 PCR技术的发明 v 1985年Kary.B.Mullis教 授发明了具有划时代意义的 PCR技术。 PCR Polymerase Chain Reaction vPCR (聚合酶链式反应)技术是一种体外快速扩增特定DNA片段的方法。 v运用PCR技术能快速特异地扩增所希望的目的DNA片段，使皮克(Pg，10－12）起始物达到微克（μg，10－6）水平。 早期PCR技术 v最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I 的Klenow片段。 v使用耐热的DNA聚合酶和自动热循环仪。 v短时间内获得大量的目的DNA片段拷贝。 主要内容 一.PCR技术的发明 二.PCR技术原理 三.PCR反应组分及反应条件 四.PCR实验操作 五.PCR应用 六. TaKaRa PCR Cycler Dice TP650 2.PCR原理 PCR原理演示 PCR扩增曲线 主要内容 一.PCR技术的发明 二.PCR技术原理 三.PCR反应组分及反应条件 四.PCR实验操作 五.PCR应用 六. TaKaRa PCR Cycler Dice TP650 PCR反应基本组分 v DNA Polymerase DNA聚合酶 v dNTP 四种脱氧核苷酸 v Buffer 缓冲溶液 v Primer F/R 引物（上游/下游） v Template 模板 PCR技术中常用的酶 vDNA聚合酶 vRNA聚合酶 v反转录酶 DNA聚合酶 v不耐热 大肠杆菌聚合酶Ⅰ的Klenow片段。 PCR反应过程中易失活。 v耐热 Taq DNA聚合酶。 PCR反应过程中不易失活。 TaKaRa DNA聚合酶的选择 TaKaRa DNA聚合酶的选择 dNTP 四种脱氧核苷酸 v组成：dATP、dTTP、dGTP、dCTP。 v浓度：溶液中最终使用浓度为20~200uM。 大于1mM会抑制Taq酶活性。 v保存：高浓度原液，PH7.0，-20℃，分装保存。 v易与Mg2+络合。 Buffer缓冲溶液 v Buffer选择：不同的酶不同buffer。 v保存：10倍浓度-20℃保存。 v Mg2+添加情况： Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 PCR引物 v引物的设计：设计原则。 v引物的退火温度Ta ： Ta=Tm-5 。 引物小于20mers：Tm=(G+C) ×4+ (A+T) × 2 引物小于20mers：Tm= 81.5+0.41×(GC)%-600/L v引物的最终浓度：0.1μM到1μM 。 引物浓度低，扩增产物少； 引物浓度高，容易会引起错配、非特异扩增、二聚体 。 PCR模板 v纯度：越纯越好。 纯度判定：1.8D260/D2802.2。 专用提取的试剂能提取到高纯度的核酸。 纯度不好，可用PCI及EtOH精制。 v浓度：模板浓度用ng