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实用 第7次课
* ???????????????????????????????????????????????????? 乙肝病毒 ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 艾滋病病毒 ???????????????????????? 病毒的电子显微镜图片 腺病毒 ???????????????????????? SARS病毒 艾滋病病毒 昆虫病毒 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 病毒--抗菌素 β干扰素可有效抑制SARS病毒增殖 天花病毒 禽流感病毒 痘病毒 H5N1禽流感病毒 天花病毒(左:病毒体,右:截面图) 流感病毒(左:病毒体,右:结构图) 艾滋病毒(左:病毒体,右:结构图) H5N1病毒放大100万倍 第五章 负染色技术 一、负染的原理 二、负染样品的制备 三、负染色液 四、负染的操作方法 五、负染色中应注意的问题 负染色技术又称为阴性染色技术。 定义:是指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样 品外周的电子密度,使样品显示负的反差,衬 托出样品的形态和大小。 负染色技术早在50年代即应用于生物大分子的研究, 后被改良为常规方法并大量用于病毒结构的研究。 与超薄切片 (正染色)技术相比其特点为: 快速简易、分辨率高(可达20? ) 目前广泛用于生物大分子、细菌、原生动物、亚细胞 碎片、分离的细胞器、蛋白晶体的观察及免疫学和细 胞化学的研究工作中,尤其是病毒病原的快速鉴定及 其结构的研究所必不可少的一项技术。 一、负染的原理 负染色技术虽然应用广泛,具有不少优点,但其原理至今尚不清楚,对其规律难以捉摸,有时在相同的条件下或成功或失败,令人费解。迄今仍对负染色原理缺乏一致的看法,根据部分实验资料,大体可归纳为以下两种看法。 密度反差原理 异常反差原理 不同原子序数的元素组成的物质具有不同的密度,电子束通过原子序数高的元素时,与其中的电子和原子核碰撞的机率较高,容易发生散射而形成负反差。一般认为任何物体假如被密度比本身大2倍以上的物质所包围或浸没时,在电镜下反差就能得到加强而形成负反差。如磷钨酸 (PTA)的密度为4,而生物样品的密度一般为1,故染色后形成负反差像。 1.密度反差原理 载网和膜 样品 染色液 用磷钨酸(PTA)对氧化镁晶体染色时,有人发现氧化镁晶体发生了异常反差。在有氧化镁晶体的载网上遮挡一部分,使其不受PTA染色。在电镜下观察发现,在同一视野内凡被PTA包绕着的氧化镁晶体全部变为透明(白色)的结晶体,未被PTA染色的氧化镁晶体则呈现不透明(暗黑色)的晶体。这种异常反差可能是因PTA在电子束照射下,负荷电子在标本周围形成了静电场,它起到一个“静电小透镜”的作用,把电子聚焦于样品上,使样品中的电流密度得到加强,结果样品图像的亮度加强,使不透明的氧化镁晶体变成透明了。 2.异常反差原理 二、负染样品的制备 用于负染技术的标本有一个共同特点,即欲观察的物体(如细菌、病毒、细胞器、酶等)均处于悬浮状态。依据样品来源和实验观察目的可以分为直接取样(如固体培养基上的微生物、噬菌体,感病的植物叶、根、茎、芽或动物的血液、体液、分泌排泄物等)和纯化样品 (包括粗提液和纯化物的悬浮液)。 1.植物病毒负染样品 2.细菌培养物 3.动物病毒组织培养物 作为一般病毒鉴别和病毒病害的诊断,只要采取浸出法即可,在病毒悬液中,浓度达到105个/ml以上,在电镜下就不难找到病毒。为使感染寄主细胞中的病毒游离出来,而又不混入大量的感染寄主细胞内含物,可在双蒸水或缓冲液中用刀片切碎组织使病毒游离出来),也可在PTA染液中用刀片切碎组织、使病毒游离在染液中。对一些含量较高的病组织,可在有支持膜的载网上滴一滴PTA,用刀片将病组织切一伤口,迅速地把伤口在载网上的染液中沾一下,亦可再切一新伤口,重复浸沾。 1.植物病毒负染样品 对一些样品数量少,又要继续活体保存毒源的样品,可
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