第五章：流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程.pdf

流式检测细胞凋亡 Annexin V 检测细胞凋亡 2 Annexin V 检测细胞凋亡 实验原理2 实验用品2 操作步骤3 Annexin V Blocking 5 凋亡细胞的 DNA 断裂片段分析 7 凋亡细胞的 DNA 断裂片段分析 实验原理7 实验用品8 操作步骤9 BrdU Flow Kits 检测细胞增殖12 BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 实验原理12 BrdU Flow Kits 试剂盒12 结果分析17 流式仪器设置指南18 线粒体膜 电位变化检测细胞凋亡22 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 实验原理22 实验用品22 样本制备23 结果分析24 注意事项24 Active Caspase-3 检测细胞凋亡 26 Active Caspase-3 检测细胞凋亡 实验原理26 实验步骤27 结果分析28 1 A nnexin V 检测细胞凋亡 A nnexin V 检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合 蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发 生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因 而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰 丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与 DNA 碎片检测比较， 使用 Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发 生磷脂酰丝氨酸外翻，所以 Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料 (如 PI 或 7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12×75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液：含0.1%NaN3 ，过滤后2-8°C保存。 3. 微量加样器和加样头。 2 4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为 10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。 5. Annexin V试剂与核酸染料： Annexin V 核酸染料 Annexin V-Biotin （Cat. No. 65872X） PI （Cat. No. 66211E ）或 Streptavidin-FITC （Cat. No. 13024D） 7-AAD （Cat. No. 34321X） Annexin V-FITC （Cat. No. 65874X） PI （Cat. No. 66211E ） Annexin V-PE （Cat. No. 65875X） 7-AAD （Cat. No. 34321X） 6. FACS流式细胞仪：上样检测。 7. CELLQuest软件：获取和分析试验数据。 8. Annexin V检测对照管： Annexin V A- 阴性对照 B-补偿 1 C-补偿 2 Biotin SAv-FITC Annexin V-Biotin PI 和