共聚焦显微镜中荧光的共定位.PDF

共聚焦显微镜中荧光团的共定位 刘美蓉编译 (分析测试中心光谱组 Tel: 010 Email: mrliu@iccas.ac.cn) ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 在多标荧光样品图像中，因两个或多个荧光团在显微结构中距离很近，经常 会有发射信号叠加，这种效应就称为共定位。目前，高特异性合成荧光团和经典 免疫荧光技术的应用、精密光切技术的应用、共聚焦和多光子显微镜提供的数字 图像处理技术等大大提高了生物样品中共定位检测的能力。 图 1 共定位在生物表述上是这样定义的：两个或多个不同的分子位于样品上同 一个物理位置。对显微镜中看到的组织切片、单个细胞或亚细胞器官，共定位 意味着不同的分子连接到同一个受体上；在数字图像方面，这个术语指的是不 同荧光分子发射的颜色分享图像中的同一个像素。在共聚焦显微镜中，样品被 记录成含有很多像元的多维阵列数字图像，每个像元代表一个三维像素。像元 的尺寸（或检测单元）由物镜的数值孔径、照明波长以及共焦检测针孔直径等 决定。因此，在一个样品中两个荧光探针的共定位，比如发绿光的Alexa Fluor 488，发橘红色光的Cy3，在图像中就是由含有红色和绿色两者贡献的像素表示 （经常产生各种各样的橘色和黄色）。 举一个例子，图 1 的一系列图表明了骨骼肌动蛋白和黏着斑蛋白侧向光学 平面上的共定位（激光扫描共聚焦显微镜中的XY 面）。这些共定位点可作为肌 动蛋白丝的成核位点，也可作为外部介质、质膜和肌动蛋白骨架之间的交联剂。 图1 （a）是Alexa Fluor 568 通道（目标对象是黏着斑蛋白），由543nm 的氦 氖激光器激发；而Figure1 （b）是Alexa Fluor488 通道(目标对象是丝状肌动 蛋白)，由488nm 的氩离子激光器激发；Figure1 （c）是前面两幅图的叠加，表 明两种荧光信号在丝状肌动蛋白纤维末端的共定位。 必须指出的是，共定位并不指的是具有相似发射光谱的荧光团出现在合成图 像的同一个像素上。准确的共定位分析只有在荧光团的荧光发射光谱足够分离且 滤色片（或光谱狭缝宽度）正确设置的情况下才有可能。荧光团发射光谱之间的 大量叠加或滤色片组合的不正确使用，都可能导致光谱串色，这种情况下共定位 的测量就没有意义。为了避免产生共定位假象，荧光团必须与照明光源的光谱认 真匹配（共聚焦中是激光线），来获得最大激发效率，同时在发射光谱之间保持 一定的分离度。在大多数情况下，对共定位分析来说，荧光团的选择对获得满意 结果极为重要。 在图 2 中，对Alexa Fluor 染料家族的光谱叠加作了比较，这在共定位实 验中是很有用的。为了比较，所有的发射光谱都做了归一化，叠加区域用灰色 阴影显示。在图 2(a) 中，绿色荧光染料Alexa Fluor 488 和橙黄色荧光染料 Alexa Fluor 555 在峰波长处显示很明显的分离，人眼也很容易能够区分。然而， 光谱叠加（灰色阴影区域）表明在Alexa Fluor 555 的发射峰上很明显有Alexa Fluor488 的发射光谱（用一条黑线标示，从发射峰到横坐标）。当Alexa Fluor 488 的荧光发射强度明显比Alexa Fluor 555 的荧光发射强时，荧光信号这么高 程度的串色使得荧光探针的分离很难。很多因素都会导致这种情况发生，比如 荧光团标的物浓度的巨大差异。因此，在共定位实验中，这些探针的组合就应 该避免，或只有当图像在多通道共焦模式采集下才可以使用，这样可以降低或 消除串色。 图 2 Alexa Fluor 探针之间的光谱叠加程度会随着探针发射峰之间的距离增加而 下降，如Figure2(b)所示。在这种情况下，Alexa Fluor 488 和深红色染料Alexa Fluor 633 与 Figure2 (a)比较，重叠区域明显降低。这两种染料人眼都很容易 区分，光谱重叠程度低在共定位实验中可使串色最小化，如每个探针的浓度相似 的话，应该可以产生较好的结果（注意：深红色的荧光染料Alexa Fluor 633 在 低浓度时通过显微镜目镜很难观