【2017年整理】分子标记辅助选择复习资料(GAU).docx

分子标记辅助选择复习资料（GAU）第一章1.DNA变性：在高温或某些化学试剂作用下双链DNA分子的两条互补的单链会相互分开的过程。2.DNA复性：当变性的外界条件消除后，互补的单链DNA又可恢复双螺旋结构的过程。3.基因组：是指一种生物或个体细胞所具有的一套完整的基因及其调控序列。4.显性标记：是指F1的多态性片段与其亲本之一完全相同。如RAPD, AFLP等。5.共显性标记：是指双亲的两个以上分子量不同的多态性片段均在F1中表现，如RFLP, SSR,SCAR, ISSR, CAPs。6.琼脂糖凝胶电泳：分离，纯化和鉴定长度为0.2—50Kb的DNA片段。应用于RAPD,RFLP,ISSR,SCAR等。7.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：分离，纯化和鉴定长度为5—500bp的DNA长度。非变性PAGE:应用于SSR等变性PAGE:应用于AFLP等8.纯化后DNA浓度的确定：OD260∕OD280=1.8 纯DNAOD260∕OD2801.8 有蛋白污染OD260∕OD2801.8 有RNA污染OD260∕OD280=2.0 纯RNAOD260∕OD2802.0 有盐，多糖等污染9.理想分子标记需达到的要求：①具有高的多态性②共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和純合基因性③能明确辨别等位基因④除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组⑤选择中性（即无基因多态性）⑥检测手段简单，快速⑦开发成本和使用成本尽量低廉⑧在实验室内和实验室间重复性好10.分子标记优越性①直接以DNA的形式表现②数量多，遍及整个基因组，检测位点近于无限③多态性高，不需要专门创造特殊的遗传材料④不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁⑤有许多分子标记表现为共显性11.分子标记类型1）以分子杂交为基础的DNA标记技术①限制性片段长度多态性（RFLP）②可变数目串联重复序序列（VNTR）③染色体原位杂交（In situ Hybridization）2）以PCR为基础的DNA标记技术①随机扩增多态性DNA（RAPD）②简单重复序列间区DNA（ISSR）③简单重复序列DNA（SSR）④扩增片段长度多态性（AFLP）⑤序列标签座位（STS）⑥序列特征化扩增区域（SCAR）3）其他①SNP（单核苷酸多态性）②EST（表达序列标签）③Retro-transproson（反转录转座子）12.DNA提取流程样品研磨（充分）——加提取液提取——沉淀DNA（离心）——TE溶解——RNase A去RNA——酚/氯仿去蛋白——沉淀DNA，并溶于TE第二章1. PCR反应的基本过程1）变性：模版DNA经过加热至94℃左右，使模版DNA双链解开成为单链，以便它与引物结合2）退火：模版DNA经加热变性成单链后，温度将至55℃左右，引物与模版DNA单链的互补序列配对结合成局部双链3）延伸：模版DNA--引物结合物在Taq聚合酶的翠催化作用下，以dNTP为反应原料，按碱基互补配对与半保留复制原理，引物5′→3′方向延伸，最终合成一条新的与模版DNA链互补的DNA双链。2.PCR反应的动力学①DNA扩增呈2n上升②Y=(1+X)n计算（Y=100时，呈2n增长）YDNA片段扩增后的拷贝数X平均每次的扩增效率n循环次数③PCR反应的平台期效应：反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称为平台期效应。3.PCR反应五要素：①引物②Taq酶③dNTP④模版DNA⑤Mg2+4.PCR引物设计的基本原则①引物长度：15-30bp,常用20bp左右。②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特殊条件下可扩增长至10kb的片段。③GC含量以40-60为宜，GC太少扩增效果不佳，GC过多易出现非特异条带。④ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。⑤避免引物内部出现二级结构，以及避免两条引物间互补，特别是3′端的互补。⑥避免 3′端的碱基，特别是最末和倒数第二个碱基，应严格要求配对。⑦引物中有或能加上合适的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑧应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性。5.PCR的优点：①特异性强②灵敏度高③简便，快速④对样本DNA的纯度要求低6.PCR过程中常出现的问题1）假阴性：不出现扩增条带原因：①模版不纯，含有蛋白、Taq酶抑制剂，或模版核酸变性不彻底②酶失活或活性不强③引物质量、浓度，两条引物的浓度是否对称是PCR失败的常见问题2）假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。原因：①引物设计不合适②靶序列或扩增产物的交叉污染3）出现非特异性扩增条带：PCR后出现的条带与预计的