第5章 紫外-可见吸光光度法.ppt

影响准确度的因素 测量条件的选择 参比溶液的选择 吸光光度法分析条件的选择 酸度的选择 酸度的选择 显色剂的用量 温度的选择 蛋白质含量测定（氨基酸测定） 核酸测定 酶及微生物代谢研究 对摩尔系数的理解二 对同一种待测物质，不同的方法具有不同的 κ ，表明具有不同的灵敏度。 例：分光光度法测铜 铜试剂法测 Cu κ426 = 1.28?104 L?mol-1?cm-1 双硫腙法测 Cu κ495 = 1.58?105 L?mol-1?cm-1 一般情况 κ 104 κ : 104 ~105 κ 105 低灵敏度 中等灵敏度 高灵敏度 仪器测量误差 吸光定律 根据误差传递公式，有 又 得 浓度测量的相对偏差 令 得 T = 0.368 = 36.8 % A = 0.434 时，仪器测量误差最小 10 8 6 4 2 0 20 40 60 80 0.7 0.4 0.2 0.1 A T/% Er (36.8) 0.434 浓度测量的相对误差与T(或A)的关系 实际工作中，应控制T在10～70％, A在0.15～1.0之间 (调c, b, ?) § 5-4 实验条件的选择 测量条件； 分析条件； 测量波长的选择 无干扰，选择测量 ?max 有干扰 A ? A ? 待测溶液吸光度的选择 控制 A = 0.2 ~ 0.8 T = 65% ~ 15% 方法 选择 C 选择 b 1 非单色光影响小 2 灵敏度高 用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。 参比溶液 I0 I 参比 样品 入射光 I0 透射光 I 原则： 扣除非待测组分的吸收 以显色反应为例进行讨论 M + R = M-R ?max 试液 显色剂 溶剂 吸光物质 参比液组成 无吸收 无吸收 光学透明 溶剂 基质吸收 无吸收 吸收 不加显色剂的试液 无吸收 吸收 吸收 显色剂 基质吸收 吸收 吸收 吸收 显色剂 + 试液 + 待测组分的掩蔽剂 若欲测 M-R 的吸收 A(样) = A(待测吸光物质) + A(干扰) + A(池) A(参比) = A(干扰) + A(池) 显色反应 有机物质 官能团强吸收 直接测定 UV-VIS 官能团弱吸收 衍生化反应 UV-VIS 显色反应 无机物质 通常通过显色反应生成吸光系数大的有色物质进行测定，以提高灵敏度。 3 2+ 桔红色 ?508 邻二氮菲 显色剂与显色反应 ： ： ： ： 助色团－NH，－OH，－X （孤对电子）ne O 生色团：－N＝N－，－N＝O， O C=S,－N （共轭双键）πe 显色反应的选择 灵敏度高，一般ε 104; 选择性好; 显色剂在测定波长处无明显吸收, 对照性好, ??max 60 nm; 反应生成的有色化合物组成恒定，稳定; 显色条件易于控制，重现性好. 酸度的影响 副反应 M + nR = MRn OH- H+ 存在型体的变化 RH = R- + H+ ?1 ?2 生成不同配比的络合物 例，磺基水杨酸 – Fe3+ pH = 2-3 FeR 紫红色 pH = 4-7 FeR2 橙色 pH = 8-10 FeR3 黄色 理论计算 M + nR = MRn OH- H+ 例：邻二氮菲-亚铁反应完全度与pH的关系 cR≈[R?]=10-4mol·L-1 以 作图， 可得适宜pH范围 实际工作，作 A ~ pH 曲线，寻找适宜 pH 范围。 A pH pH3-8 M + nR = MRn 定量反应 理论计算 c(R) c(R) c(R) 实际工作，作 A-CR 曲线，寻找适宜 CR 范围。 * 第五章 紫外-可见吸光光度法 §5-1 吸光光度法的基本原理 §5-2 光的吸收定律—郎伯-比耳定律 §5-3 紫外-可见吸光光度计 §5-4 实验条件的选择 §5-5 吸光光度法应用示例 化学分析：常量组分(1%), Er : 0.1%-0.2% 依据化学反应, 使用玻璃仪器 化学分析与仪器分析方法比较 仪器分析：微量组分(1%), Er : 1%-5% 依据物理或物理化学性质, 需要特殊的仪器 例: 含Fe约0.05%的样品, 称0.2 g, 则m(Fe)≈0.1 mg 重量法 m(Fe2O3)≈0.14 mg, 称不准 容量法 V(K2Cr2O7)≈0.02 mL, 测不准 光度法 结果0.048%～0.052%, 满足要求 准确度