微生物培养筛选技术及操作.doc

污染物高效降解微生物的分离培养 微生物是地球生态系统中最重要的分解者，也是人类生存环境的重要组成部分，同时也是人类极其宝贵的资源库。它与人类的生产、生活，对人类的生存发展，有着十分密切的关系。 人们在治理污染、保护环境的不懈努力中，在为遇到种种难题所困扰的同时，已经自觉或不自觉地利用并发挥着环境有益微生物的作用，而且在实践中越来越认识到微生物在污染物降解、资源再生利用、绿色产品生产、生态环境保护等方面的重要作用和巨大潜力。获取高效菌种是开发应用环境有益微生物、并进一步实现产业化的基础，是该领域研究、开发工作的源头，也是产业化发展的核心与关键。 9.8.1 分离培养的基本原则和方法 确定分离培养目标 了解目标菌（微生物）的分布、营养、生长等特点，以及它们具有的或应具有的一些功能特性，并进而制定试验方案。如用于生物脱氮或NH3-N去除、转化的硝化细菌和反硝化细菌的分离，前者应是具有氨氧化作用的亚硝酸细菌和能氧化亚硝酸为硝酸的硝酸细菌。又如用于有机生活垃圾的快速处理与利用的高效微生物的分离，这些微生物的作用应能有效地使垃圾达到无害化、减量化、资源化，因此它们的发酵温度应该很高，即应具有耐高温的特性，以及对蛋白质、纤维素等有机物的很高的分解能力。 选择分离源 以目标微生物上述特征为依据，选择并确定分离源。该分离源应具备以下条件： （1）所处的条件较有利于目标微生物的生长。 （2）存在有较大的数量。 （3）有可能具备为目标菌设定的功能特性。 分离“筛”的设定是选择培养法的核心 （1）选择培养基的利用。 根据目标微生物特定的营养要求，设计相应的选择培养基。例如，可利用不加氮源的培养基来分离固氮菌；解酚菌的培养基中应以酚作为碳源。 （2）选择培养条件的利用。 可利用目标菌对氧、光、pH、温度、盐分、压力等的不同要求来设定选择培养条件。例如，可用摇床培养来满足好氧菌生长时对氧的要求；为分离芽孢杆菌，可利用芽孢耐高温的特性，预先对样品用800C水浴处理10～20分钟。 （3）对毒物、抗菌素等特殊的敏感性或耐受性的利用。 例如，分离放线菌时可加重铬酸钾来抑制细菌和霉菌生长，其加量为每300ml改良高氏一号培养基中加3%重铬酸钾1ml。 分离样品的破碎、分散处理 进行微生物分离培养前，必须对分离样品，如土壤、淤泥、活性污泥或生物膜等等充分破碎、分散，尽可能使着生在土壤粒子内外的微生物、组成污泥菌胶团的微生物都分散成单个细胞悬浮在样品中。样品分散程度关系到分离培养与计数结果的准确性，必须十分重视。 具体可采用以下方法： 在放有少量玻璃珠的无菌三角瓶中加入样品(土壤、淤泥、活性污泥、生物膜等)，再加入0.01%的焦磷酸钠作为解絮剂，用旋涡振荡器振荡使样品充分分散后，再用超声波破碎（在冰浴中进行），然后以无菌水稀释备用。 富集培养 利用目标微生物对营养、生长条件、毒物敏感性、生长速度等方面的特点，也即利用设定的筛子先进行富集培养，使分离源中的目标微生物数量增加，有用的性状得到改善与提高。 （1）增加目标微生物的数量，提高优势度。 （2）与定向驯化培养相结合，提高、改善目标微生物某些特定的性状。 （3）减少非目标微生物的数量。 （4）有利于获得与特定环境相融性好的目标微生物群体。 目标微生物的分离纯化 （1）用稀释平板法(混菌、涂布或划线分离)或MPN法进行分离纯化。 挑取单菌落，获得一批菌株，并进一步作纯化分离，最后得到纯菌株。 （2）性状确认，并与筛选相结合，好中选优。 纯化分离菌株的保存 菌种保存时一般都要求不受杂菌污染，菌株变异很少，并能尽量保持细菌的形态和生理性状不发生变化。同时，还应注意以下事项： （1）做好菌种保存记录，注明菌株名称、分离年月日、分离者姓名、 分离地点等，还应记录有关菌株性质的数据。 （2）为防止杂菌污染及意外事故，一种菌应保存2～3支试管备用。 （3）原始菌株必须妥善保存。 具体保存方法请参考有关文献。 9.8.2 细菌、放线菌、真菌和酵母菌的计数与分离 计数用培养基 细菌、放线菌在清蛋白琼脂培养基上，280C、培养７～10天计数。 清蛋白琼脂培养基配方： 蛋清蛋白 0.25 g Fe2(SO4)3 微量 葡萄糖 1.0g 琼脂 15 g K2HPO4 0.5g 水 1000 ml MgSO4·7H2O 0.2 g pH 6.8～7.0 蛋清蛋白用0.1N NaOH数mL溶解，加一滴酚酞，使呈微红色即可。该培养基适于营养贫瘠型类群计数使用。 非贫营养型细菌的计数可采用牛肉膏－蛋白胨琼脂培养基。 牛肉膏－蛋白胨琼脂培养基配方： 牛肉膏 3～5g 琼脂 15～20g 蛋白胨 10