兔冬眠心肌模型骨髓干细胞动员及心肌组织中血管内皮生长因子基.doc

兔冬眠心肌模型骨髓干细胞动员及心肌组织中血管内皮生长因子基 　【摘要】 目的: 探讨兔冬眠心肌模型外周血骨髓干细胞的变化及缺血心肌组织中血管内皮生长因子基因表达的变化. 方法: 选用雄性日本大耳白兔为研究对象，通过开胸不全结扎冠状动脉左前降支方法建立冬眠心肌动物模型. 将成功制备的24只兔模型随机分为4组，即缺血3 d组、缺血7 d组、缺血28 d组和假手术对照组. 应用流式细胞术测定各组模型动物外周血单个核细胞中CD34+细胞百分率，应用实时荧光定量PCR方法测定各组动物模型缺血心肌组织中血管内皮生长因子mRNA表达. 结果: 兔冬眠心肌模型于手术后出现骨髓干细胞动员，1 wk内达高峰，随时间延长逐渐减弱；同时相应地出现手术后1 wk内缺血心肌组织中血管内皮生长因子mRNA表达明显升高，随时间延长表达逐渐降低. 结论: 冬眠心肌可通过组织局部血管内皮生长因子表达增高而动员骨髓干细胞进入外周血. 【关键词】 心肌顿抑 骨髓干细胞 动员 血管内皮生长因子 　　0引言 　　干细胞治疗缺血性心脏病在动物实验和小规模临床试验均取得了很大进展［1-2］. 目前这方面的研究主要集中在两方面，即急性心肌梗死和心肌梗死后慢性心衰，这两方面均属于冠心病的严重类型和晚期阶段. 冬眠心肌属于存活心肌，大多存在于冠心病的早期阶段即未发生心肌梗死时，此时同样存在心肌缺血和局部微环境的改变. 本研究以兔冬眠心肌模型为研究对象，探讨心肌冬眠状态下外周血骨髓干细胞的变化及心肌组织中血管内皮生长因子（VEGF）基因表达的变化，为干细胞移植治疗冬眠心肌提供理论基础. 　　1材料和方法 　　1.1材料兔淋巴细胞分离液购于北京普利莱基因技术有限公司；CD34单克隆抗体及阴性对照购于B.D公司；RevertAidTM First Stand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒购于Fermentas公司；SYBR ExScriptTM RTPCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒购自TaKaRa大连宝生物工程有限公司；Trizol购于Invitrogen公司. Beckman Coulter公司流式细胞仪和美国BioRad公司iQ5型 Real Time PCR仪分别由西安交通大学医学院实验中心和第一附属医院心内科提供. 选用雄性日本大耳白兔30只，体质量2~3 kg，购于西安交通大学医学院实验动物中心. 实验前，实验动物在动物中心适应性喂养1 wk. 　　1.2方法 　　1.2.1兔冬眠心肌模型制备和分组日本大耳白兔30只，30 g/L戊巴比妥钠（30 mg/kg）耳缘静脉麻醉. 随后经耳缘静脉注射利多卡因（1 mg/kg），以预防冠状动脉结扎过程中发生室性心律失常. 将兔仰卧位固定于手术台上，备皮，沿胸骨左缘剪断左侧第3~4肋软骨，暴露纵隔和心脏，保持两侧胸膜完整，距左冠状动脉冠状窦开口4~5 mm处，用50无损伤带针缝合线穿过左前降支下方，将直径分别为0.8 mm和0.1 mm的粗、细丝线各一根置于左前降支前缘，将丝线与左前降支一起结扎，随后迅速抽出细丝线，相当于血管90%狭窄. 观察左前降支远端血管充盈不明显，左心室前壁和心尖部心肌颜色稍变暗，表明结扎成功. 假手术组将缝合线穿过左前降支下方，但不结扎. 术后常规饲养，肌肉注射青霉素（40万U/只）3 d预防感染. 术中及术后2 d内共死亡6只，均为模型组，原因为气胸和失血过多. 术后第3 d对实验兔行超声心动图检查，观察左室前壁出现节段性运动障碍，未出现心肌梗死征象，提示手术成功. 将存活的24只兔随机分为缺血3 d组，缺血7 d组、缺血28 d组和假手术组，每组6只. 　　1.2.2外周血单个核细胞中CD34+百分率测定各组每只兔耳缘静脉取血5 mL，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞. 取2×106个细胞，分别加入10 μL CD34单克隆抗体和荧光素藻红蛋白标记（阴性对照），室温避光孵育20 min，用流式细胞仪检测外周血中CD34+细胞百分率. 　　1.2.3缺血心肌组织中VEGF mRNA表达(1)引物设计：根据美国国立图书馆基因数据库(Genebank)检索VEGF基因序列，应用软件Primer 5.0设计引物，由北京三博远志生物公司合成引物. VEGF上游引物为5′GGC AGA AGA AGG AGA CAA TAA ACC3′， 下游引物为5′CAG AGG CAC GCA GGA AGG3′，产物大小361 bp；管家基因βactin上游引物为5′CCA TCT ACG AGG GCT ACG C3′，下游引物为5′CGG CTG TGG TCA CGA AGG3′，产物大小397 bp. （2）标本采集和总RNA提取：各