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兔纤维环细胞及骨髓间充质干细胞共培养初步探究
兔纤维环细胞及骨髓间充质干细胞共培养初步探究
作者:张福勇,吴小涛,王运涛,鲍军平,朱磊,邱匀峰
【摘要】 目的:初步探讨骨髓间充质干细胞(BMMSCs)与纤维环(AF)细胞的共培养对细胞增殖及主要细胞外基质的影响,进一步确定BMMSCs移植对椎间盘退变的预防和治疗作用。方法:分别培养兔的BMMSCs与AF细胞,将两种细胞按1∶1的比例混匀,利用离心管培养技术培养3周后取材,大体观察并行HE染色;使用荧光染料Hoechst33258检测细胞增殖;通过实时荧光PCR对Ⅱ型胶原、蛋白多糖含量进行测定。结果:在体外培养3周后,细胞团体积达到最大,涂片染色显示共培养组细胞致密,细胞增殖较对照组明显,实时荧光PCR检测结果显示Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA表达增强。结论:在离心管内三维培养条件下,BMMSCs与AF细胞共培养能够促进增殖,增加Ⅱ型胶原和蛋白多糖的含量。
【关键词】 骨髓间充质干细胞; 纤维环细胞; 生物医学工程; 细胞培养; 兔
下腰痛是一种常见的骨科疾患,发病率高,75%~80%的人在其一生中的某个阶段都会受到下腰痛的困扰。椎间盘退变是导致下腰痛最常见的原因,临床常用的手术及保守治疗虽然能够取得一定的治疗效果,但并非针对椎间盘退变本身,目前的治疗方法并不能够阻止椎间盘的退变[1] 。椎间盘退变的合理解决方法就是对退变的椎间盘进行生物学修复。椎间盘有外层的纤维环(AF)、内部的髓核及上下终板构成。在椎间盘退变防治研究中,AF的生物学作用越来越受到人们的重视,维持和修复AF的完整性有着重要的意义[2] 。本研究观察骨髓间充质干细胞(BMMSCs)与AF细胞共培养后是否可以促进细胞增殖及蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达,达到阻止和抑制椎间盘退变的目的。
1 材料与方法
1.1 实验仪器与材料
实验仪器包括721分光光度计(上海市仪器厂),高速冷冻离心机(德国Heraeus公司),倒置荧光相差显微镜(德国Zeiss公司),5%CO2细胞培养箱(德国Heraeus公司),数码照相机(日本Canon公司);实验材料有木瓜蛋白酶(E.Merck公司),100%胎牛血清(杭州四季青生物公司),胰蛋白酶(美国 Sigma公司),台盼蓝试剂(美国Sigma公司),塑料离心管(Corning公司),LG-DMEM培养基、Ⅱ型胶原酶、Hoechst33258和Calf Thymus DNA等试剂(Gibco公司);新西兰大白兔由江苏省农业科学院提供。实时荧光PCR委托上海拓科生物技术有限公司检测。
1.2 实验步骤
1.2.1 取材
1.2.1.1 BMMSCs的分离 取1月龄新西兰大白兔30只,雌雄不拘,体重0.5~0.6 kg,1%戊巴比妥钠按2 ml·kg-1 的剂量施以全身麻醉,无菌操作下切取兔的股骨,两端剪断,用PBS液冲洗,收集细胞,离心后用15%的胎牛血清DMEM培养液制备成细胞悬液,然后于37 ℃、5%CO2、100%饱和湿度条件下培养。5 d后第1次换液,以后每隔3 d换液1次,培养至第3代[3]。
1.2.1.2 AF细胞的分离 取1月龄新西兰大白兔54只,雌雄不拘,体重0.5~0.6 kg,同上法麻醉后无菌条件下取出兔的脊柱,剔除周围软组织,取出椎间盘,放入含有PBS的培养皿内,用眼科剪去除终板及髓核组织,将AF的最外层及最内层去除,留取中间部分(图1),用PBS液冲洗3遍后,用眼科剪将组织剪成1 mm3大小,移入含有20 mlⅡ型胶原酶的培养皿内消化6~8 h,120目过滤器过滤后PBS液洗涤3遍,用15%的胎牛血清DMEM培养液制备成细胞悬液,置37 ℃、5%CO2、100%饱和湿度条件下培养。5 d后第1次换液,以后每隔3 d换液1次,培养3周后待用[4]。
图1 终板及髓核被清除后的AF
Fig 1 AF after nucleus pulposus and endplate were removed
1.2.1.3 共培养模型的建立及分组 单层培养的细胞经胰酶消化后,按照每管含5×105 BMMSCs、AF细胞或1∶1的比例混合细胞,将细胞悬液移入15 ml塑料离心管内,再加入DMEM培养液至5 ml,其中含10%的胎牛血清、100 U·ml-1青霉素、100 μg·ml-1链霉素,pH 7.4,以20×g的离心力低速离心5 min形成微球,置于37 ℃、5%CO2、100%饱和湿度下培养,由此形成3个观察组,即BMMSCs组、AF细胞组和共培养组。5 d后第1次换液,以后每隔3 d进行半量换液,培养至第21天对各项指标进行检测[4]。
1.2.2 观察指标
1.2.2.1 组织学检查 取离心管内培养的细胞团,大体观察并涂片、固定,然后行HE染色,观察细胞形态和组织结构。
1.2.2.2
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