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内毒素对Akt蛋白表达及磷酸化水平影响 　作者：程晓刚，尹华华，夏 浩，闫 红，刘道城，李磊 【摘要】 　　目的 探讨内毒素脂多糖(lipopolysaccharide LPS)在体内外对Akt蛋白表达和磷酸化水平的影响。方法 不同剂量LPS攻击RAW 264.7细胞，检测不同时相点细胞Akt蛋白表达和磷酸化水平。小鼠腹腔注射LPS 6 h后检测肺组织Akt蛋白表达和磷酸化水平。结果 不同剂量LPS攻击RAW 264.7细胞，细胞Akt蛋白表达没有显著差异，磷酸化水平增加。内毒素血症小鼠肺组织Akt蛋白表达无显著变化，磷酸化水平降低。结论 LPS在体内外对Akt蛋白磷酸化作用不同，体外Akt蛋白磷酸化水平增高，但内毒素血症小鼠体内出现Akt蛋白磷酸化水平异常降低。 【关键词】 脂多糖　Akt　磷酸化　内毒素血症 Abstract：Objective To explore the effects of LPS on Akt expression and phosphorylation.Methods RAW264.7 cells were attacked with LPS.The Akt protein expression and phosphorylation level were detected by Western blot.The Akt protein phosphorylation level in the lung tissue of mice was detected by Western blot 6 hours after LPS attack.Results The Akt protein expression of RAW264.7 cells showed no obvious difference after attacks of different-dose of LPS,but their phosphorylation level were increased significantly.Whereas the Akt protein phosphorylation level decreased in the lung tissue of mice 6 hours after LPS attack.Conclusion The Akt protein phosphorylation level of Akt protein were different after LPS attack in vitro and in vivo.The Akt protein phosphorylation were increased obviously in vitro,but decreased in a murine model of endotoxemia. Key words:LPS；Akt；phosphorylation；endotoxemia LPS为G-菌细胞壁最外层结构，诱导单核/巨噬细胞表达多种前炎性介质，引起创伤后的免疫失调。LPS与血浆中的LPS结合蛋白（LBP）结合，再与靶细胞表面受体CD14等结合，激活CD14-TLR4-MD-2复合体，引起下游信号传递，导致TNF-α、组织因子 (Tissue factor，TF)等因子的表达。尽管LPS刺激引起单核/巨噬细胞TNF-α及组织因子TF表达的正性调控信号通路已有较多研究，然而，限制这些基因表达的信号通路仍不明了［1］。 反馈调控是机体维持自身平衡非常重要的生理机制，虽然目前对LPS刺激TLR4活化信号通路的负性调控有一些研究，然而对其调节的具体机制尚不十分明确［2］。新近研究显示，PTEN/PI-3K/Akt通路在炎症和内毒素血症的发生方面可能具重要调控作用［3］。但LPS对PTEN/PI3K/Akt通路关键分子Akt蛋白及磷酸化水平的影响尚不十分清楚。本研究拟在体外与体内分别检测LPS刺激后Akt蛋白及磷酸化水平的表达变化，以便对LPS信号通路的调控途径有更深入的了解。 1 材料与方法 1.1 材料 Balb/c小鼠12只，6～8周龄，雄性，质量20～21g。（购自重庆医科大学实验动物中心）；兔抗Akt蛋白多克隆抗体及磷酸化Akt小鼠单克隆抗体购自Cell Signaling Technology(USA)；β-actin小鼠单克隆抗体购自Sigma(USA)；Goat anti-Mouse 二抗，Goat anti-Rabbit 二抗及CTL化学发光试剂盒购自Pierce(USA)；LPS（0111：B4）购自Sigma（USA）；蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂购自上海申能博彩公司；RAW 264.7细胞株购自中